Conception rationnelle de protéines fluorescentes ultrastables et photocommutables de manière réversible pour un super

Rapports scientifiques volume 6, Numéro d'article : 18459 (2016) Citer cet article

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Les protéines fluorescentes phototransformables sont au cœur de plusieurs approches de nanoscopie. Cependant, il n'existe pas encore de variante disponible permettant l'imagerie en super-résolution dans les compartiments cellulaires qui maintiennent des conditions oxydatives. Ici, nous rapportons la conception rationnelle de deux protéines fluorescentes réversiblement commutables capables de se replier et de photocommuter dans le périplasme bactérien, rsFolder et rsFolder2. rsFolder a été conçu par hybridation de Superfolder-GFP avec rsEGFP2 et a hérité des propriétés de repliement rapide du premier ainsi que de la commutation rapide du second, mais au prix d'un contraste de commutation réduit. La caractérisation structurelle des mécanismes de commutation de rsFolder et rsEGFP2 a révélé différents scénarios pour l'isomérisation cis-trans du chromophore et a permis de concevoir rsFolder2, une variante de rsFolder qui présente un contraste de commutation amélioré et se prête à la nanoscopie RESOLFT. Les rsFolders peuvent être efficacement exprimés dans le périplasme d'E. coli, ouvrant la porte à l'étude à l'échelle nanométrique de protéines localisées dans des compartiments cellulaires jusqu'alors non observables.

La visualisation à l'échelle nanométrique des détails intracellulaires dans les cellules vivantes par microscopie à super-résolution repose souvent sur l'utilisation de protéines fluorescentes "phototransformables" (PTFP) comme marqueurs génétiquement codés1. En conséquence, l'ingénierie des PTFP avec des propriétés biochimiques ou photophysiques améliorées a favorisé le développement d'une grande variété d'approches de nanoscopie2,3. Notamment, des méthodes telles que RESOLFT (REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions)4, SIM non linéaire (Structured Illumination Microscopy)5 ou pcSOFI (photochromic Stochastic Optical Fluctuation Imaging)6 exploitent des protéines fluorescentes réversiblement commutables (RSFP) capables de basculer de manière répétée entre un état fluorescent (« on ») et un état non fluorescent (« off »). Dans les RSFP verts dits à "commutation négative", la transition marche-arrêt entre en concurrence avec l'émission de fluorescence lors de l'illumination par la lumière cyan (~ 490 nm), tandis que la transition arrêt-marche répond rapidement à l'illumination par la lumière violette (~ 405 nm). La sous-famille des RSFP négatifs a d'abord été composée de Dronpa7 et de ses variants8,9 et s'est progressivement enrichie d'autres protéines d'origine anthozoaire (coraux et anémones) telles que rsCherryRev10, rsTagRFP11, les mGeos12 et les biphotochromes IrisFP13 et NijiFP14. Cependant, le développement de la nanoscopie RESOLFT dans les cellules vivantes nécessite des RSFP qui commutent efficacement même à faible puissance d'éclairage (pour minimiser les photo-dommages), affichent une fluorescence résiduelle minimale à l'état éteint (pour maximiser le contraste) et sont très résistants à la fatigue de commutation (pour supporter un grand nombre de cycles de commutation marche-arrêt successifs). Il a été découvert que des variants conçus à partir de protéines fluorescentes d'origine hydrozoaire (méduses) et notamment de la célèbre EGFP, pouvaient répondre à ces exigences, donnant naissance à rsEGFP15 et rsEGFP216. Très récemment, des variants de rsEGFP obtenus par évolution dirigée ont été rapportés qui mûrissent et s'expriment plus efficacement dans le cytosol des cellules de mammifères17. Des RSFP d'origine anthozoaire avec des propriétés de photocommutation améliorées ont également été introduits, y compris le commutateur positif Kohinoor18 évolué à partir de Padron8 et le commutateur négatif Skylan-S, évolué à partir de mEos3.119.

Malgré le développement intensif des PTFP, certaines sous-structures cellulaires restent peu explorées à l'échelle nanométrique, en particulier les compartiments où se déroule le repliement oxydatif, comme le peroxysome, le réticulum endoplasmique, l'espace intermembranaire mitochondrial ou le périplasme bactérien. Ces compartiments abritent pourtant un grand nombre de macromolécules clés, impliquées par exemple dans l'absorption de médicaments, la production d'énergie ou le métabolisme oxydatif. La principale raison de cet écart dans le domaine de la super-résolution est que les protéines fluorescentes sont généralement incapables de se replier correctement et d'émettre de la lumière dans des environnements hautement oxydants20. Le développement d'un PTFP capable de repliement oxydatif est donc nécessaire pour faciliter l'imagerie à super-résolution de tels compartiments dans les cellules vivantes.

Le périplasme des bactéries Gram-négatives, parfois appelé le hall d'entrée de la cellule et représentant 20 à 40 % de son volume total21, est impliqué dans des processus importants tels que la division cellulaire, la signalisation environnementale et le transport cellulaire22. En conséquence, il héberge une variété de protéines impliquées dans l'action antibiotique (par exemple, les protéines de liaison à la pénicilline) et la résistance (par exemple, les bêta-lactamases, les porines et les composants des pompes à efflux)23,24. La compréhension des processus moléculaires qui se déroulent dans le périplasme présente donc un intérêt à la fois fondamental et biomédical. Quatre types de protéines font face à un repliement oxydatif dans le périplasme : les protéines sécrétées, les protéines périplasmiques, les protéines de la membrane interne et les protéines de la membrane externe. La plupart des protéines de la membrane externe, sécrétées et périplasmiques sont exportées de manière post-traductionnelle, généralement à l'état déplié via la voie de sécrétion Sec et plus rarement à l'état replié via la voie de sécrétion du translocon jumeau de l'arginine (Tat)25,26. Les protéines de la membrane interne sont insérées de manière co-traductionnelle, après la reconnaissance de la chaîne polypeptidique naissante émergeant du ribosome par la particule de reconnaissance du signal bactérienne (SRP) et la liaison du complexe tripartite au récepteur SRP intégré à la membrane27. Il a été démontré que les systèmes SRP et Sec peuvent agir en coopération pour assurer une insertion correcte des protéines membranaires qui abritent des domaines périplasmiques hydrophiles substantiels28. De plus, certaines protéines périplasmiques sont transloquées par la voie SRP. Bien que la fluorescence périplasmique de la GFP puisse être observée après la translocation post-repliement à travers Tat22, le repliement de la GFP après la translocation à travers Sec s'est avéré problématique à l'intérieur du périplasme en raison de la formation indésirable de ponts disulfures intermoléculaires dans l'environnement oxydatif. Bien que non fluorescents, ces agrégats de GFP ont montré une forte cytotoxicité29. En revanche, Superfolder-GFP20, 22, 30, 31, une variante de la GFP conçue pour une maturation rapide et une cinétique de repliement, s'est avérée capable de permettre des études de localisation des protéines périplasmiques après le transport médié par Sec, notamment lorsque la voie SRP était utilisée30. Pourtant, Superfolder-GFP n'est pas phototransformable et n'est donc pas adapté à l'imagerie en super-résolution.

Nous rapportons ici la conception rationnelle basée sur la structure de deux nouveaux RSFP superpliants, rsFolder et rsFolder2. Les deux RSFP sont capables de se replier et de photocommuter efficacement dans le périplasme bactérien, ouvrant la porte à l'imagerie nanoscopique en direct de macromolécules dans de tels compartiments «hostiles». Plus précisément, nous montrons ici que rsFolder2 est adapté à l'imagerie RESOLFT du périplasme bactérien.

Nous avons pensé que Superfolder-GFP et rsEGFP2, partageant la GFP comme un "ancêtre" commun, pourraient être hybridés par une conception rationnelle pure pour fournir une variante réversiblement commutable capable d'un repliement efficace dans l'environnement oxydatif du périplasme d'E. coli. Les quatre mutations ponctuelles qui ont permis l'évolution de l'EGFP en rsEGFP2 (T65A, Q69L, V163S, A206K)16 ont donc été conçues dans Superfolder-GFP, donnant un nouveau PTFP que nous avons nommé rsFolder. La mutation T65A, connue pour conférer des capacités de photoswitching à rsEGFP216, cible le chromophore Superfolder-GFP lui-même. Deux des trois autres mutations ciblent des positions d'acides aminés (163 et 206) qui ont déjà été modifiées dans Superfolder-GFP par rapport à l'ancêtre GFP (voir l'alignement de séquence dans la Fig. S1 supplémentaire). Nous avons choisi de conserver ces mutations rsEGFP2 dans rsFolder car il a été constaté qu'une sérine en position 163 est essentielle pour améliorer le contraste de commutation dans rsEGFP216, tandis qu'une lysine en position 206, face au solvant, confère un caractère monomère fort aux variants GFP32. Ainsi, par rapport à rsEGFP2, rsFolder présente six mutations ponctuelles (S31R, N40Y, S100F, T106N, Y146F et M154T), dont une seule se produit à proximité du chromophore (Y146F) (Fig. S1, Fig. S2b).

Les propriétés photophysiques de rsFolder et de rsEGFP2 sont très similaires (Tableau 1, Fig. 1 et Fig. S3). Comme rsEGFP2, rsFolder est un photocommutateur négatif efficace, à la fois sous forme purifiée (Fig. 1a) et dans des cellules vivantes (Fig. S4). Les deux protéines présentent des propriétés spectrales d'absorbance et de fluorescence presque identiques (Fig. 1b, c). Le pKa du chromophore rsFolder (pKa = 5,5) est légèrement inférieur à celui de rsEGFP2 (pKa = 5,9) (Fig. S5, Tableau 1). Les deux RSFP mûrissent plus lentement que Superfolder-GFP (~ 40 min), avec des demi-temps respectifs de ~ 2, 5 h (rsFolder) et ~ 3 h (rsEGFP2), (Fig. 1d, Tableau 1). rsFolder est également monomère (Fig. S6, Tableau S1) et se replie aussi rapidement que Superfolder-GFP (Fig. 1e). Ainsi, les données photophysiques et biochimiques suggèrent que rsFolder a hérité à la fois des propriétés de repliement rapide de Superfolder-GFP et des propriétés de commutation rapide de rsEGFP2. Son émission de fluorescence est en outre maintenue sur une large gamme de pH (Fig. S7).

Caractéristiques spectroscopiques et biochimiques.

Superfolder-GFP (orange), rsEGFP2 (violet), rsFolder (cyan) et rsFolder2 (marine). (a) Cycle de commutation à faible intensité d'éclairage (488 nm : 1,9 mW/cm2, 405 nm : 2,2 mW/cm2). rsFolder s'éteint plus rapidement que rsEGFP2 mais atteint une fluorescence résiduelle plus élevée à l'état désactivé (encart). rsFolder2 se comporte de la même manière que rsEGFP2 en termes de vitesse de commutation et de contraste. La commutation résiduelle apparente est uniquement due à son excitation de fluorescence directe par le laser à 405 nm. ( b, c ) Spectres d'excitation et d'émission de rsFolder (b, cyan) et rsFolder2 (c, marine), par rapport à ceux de rsEGFP2 (violet). ( d ) La cinétique de maturation des chromophores montre que les chromophores de rsEGFP2, rsFolder et rsFolder2 (Ala-Tyr-Gly) mûrissent à des vitesses similaires tandis que celui de Superfolder-GFP (Thr-Tyr-Gly) mûrit plus rapidement. Les barres d'erreur représentent l'écart type sur des mesures en triple. ( e ) Cinétique de récupération de la fluorescence lors du repliement après dénaturation chaotropique par le chlorhydrate de guanidine. Le signal de fluorescence a été contrôlé en continu à 25°C. Les barres d'erreur représentent l'écart type sur des mesures en triple. ( f ) Relaxation thermique des états photoéteints suivis à l'absorbance maximale à l'état activé pour rsEGFP2 (violet), rsFolder (cyan) et rsFolder2 (marine). Voir le tableau 1 pour les valeurs.

rsFolder affiche pourtant ses propres particularités. Premièrement, la stabilité thermique de son état désactivé (~ 64 heures) est 15 fois supérieure à celle de rsEGFP2 (Fig. 1f et Tableau 1) et, à notre connaissance, sans précédent parmi les RSFP. En outre, rsFolder présente un niveau de fluorescence résiduelle plus élevé après la désactivation que rsEGFP2, ce qui entraîne un contraste de commutation réduit (Fig. 1a, Fig. S4 et Tableau 1). Cette caractéristique découle de l'augmentation du rendement quantique off-to-on et du coefficient d'extinction plus élevé de l'état off à 488 nm (tableau 1, figure S3), devrait compromettre l'imagerie RESOLFT. Une explication possible de ces différences est que les deux RSFP commutent par des mécanismes différents. Des connaissances au niveau moléculaire sont nécessaires pour étayer davantage cette hypothèse.

À l'exception de Dreiklang33, il a été proposé à tous les RSFP d'origine hydrozoaire de subir une isomérisation cis-trans de leur chromophore lors de l'arrêt, par analogie avec les RSFP d'origine anthozoaire34. Cette hypothèse a été confirmée récemment par des études structurales sur le variant rsGreen0.7 de rsEGFP17. Il n'est cependant pas clair si rsEGFP2 et rsFolder commutent par le même mécanisme ou non. L'inspection des spectres d'absorption de rsEGFP216 et rsFolder dans leur état désactivé révèle une large bande centrée à ~ 400 nm. Cela suggère fortement que dans les deux protéines, la règle classique s'applique - c'est-à-dire que la protonation du chromophore se couple avec l'isomérisation. Pour faire la lumière sur les mécanismes de commutation de rsFolder et rsEGFP2, nous avons résolu leurs structures cristallographiques dans les états activé et désactivé (Fig. 2 et Tableau 2). La commutation marche-arrêt a été déclenchée par l'illumination des cristaux avec un laser à 488 nm couplé à la fibre. Les modèles ont été affinés à une résolution de 1,45 Å (état activé) et 1,50 Å (état désactivé) pour rsEGFP2 et à une résolution de 1,50 Å (état activé) et 2,35 Å (état désactivé) pour rsFolder, respectivement. Les cartes expérimentales de différence de Fourier fournissent la preuve que dans les deux RSFP, la désactivation résulte bien de l'isomérisation cis-trans du chromophore (Fig. S8). Pourtant, nos structures révèlent des différences majeures entre les mécanismes de photocommutation de rsEGFP2, rsFolder et Dronpa, l'archétype anthozoaire RSFP35. Dans Dronpa et d'autres RSFP négatifs tels que mTFP0.736 ou IrisFP13, une réorganisation structurelle drastique de l'environnement chromophore est observée lors de la commutation. La triade Glu144-His193-Glu211 étroitement liée à l'hydrogène dans la conformation cis est remplacée par la triade Glu144-Arg66-Glu211 dans la conformation trans, avec His193 ou Arg66 stabilisant le chromophore par empilement π et interactions cation-π avec le fragment p-hydroxybenzylidène, respectivement34. Dans rsEGFP2 et rsFolder, au contraire, aucune réorganisation de ce type des réseaux de liaisons H n'est observée et les changements structurels sont limités à l'environnement proche du chromophore phénolate (Fig. 2 et Fig. S8).

Structures cristallines de rsEGFP2 et rsFolder dans leurs états activé et désactivé.

Des modèles raffinés des chromophores et des résidus environnants sont présentés pour rsEGFP2 (a) et rsFolder (b). Les états initiaux sont affichés avec des atomes de carbone colorés (violets et cyan pour rsEGFP2 et rsFolder, respectivement). Les états désactivés sont représentés par des carbones gris. Les cartes de densité électronique de différence Fobs(off)-Fobs(on) profilées à ± 4,5 σ (jaune : négatif ; bleu : positif) mettent en évidence les atomes présentant un mouvement notable de l'état fluorescent (conformation cis) à l'état photocommuté (conformation trans). Les liaisons H (2,7 à 2,9 Å) sont représentées par des lignes pointillées.

Dans les RSFP négatifs pour les anthozoaires, il a également été remarqué que l'énergie libre de l'état trans est abaissée par la capacité de Ser142, qui maintient une forte liaison H avec le fragment hydroxybenzylidène à l'état cis, à trouver un autre partenaire de liaison H lors de l'isomérisation du chromophore35,37. Une situation similaire est observée dans rsEGFP2, où His149, jouant le même rôle que Ser142 dans Dronpa (distance au chromophore phénolate : 2,7 Å), trouve Tyr146 comme partenaire de liaison H de substitution à l'état trans du chromophore. Ce mécanisme de photocommutation est identique à celui récemment rapporté pour rsGreen0.717. Il convient de noter que dans ces trois RSFP, le phénolate du chromophore à l'état désactivé perd toutes les liaisons H avec l'échafaudage du tonneau, n'étant lié qu'à une molécule d'eau structurelle, jusqu'alors absente de la structure à l'état activé (Fig. 2a). Cependant, un scénario radicalement différent est observé dans rsFolder, où Tyr146 est remplacé par une phénylalanine hydrophobe, l'une des mutations héritées de Superfolder-GFP. Par conséquent, le schéma de commutation présenté par rsFolder est unique. À l'état activé, l'oxygène phénolate du chromophore cis est lié par H à Thr204, une molécule d'eau et His149. Lors de l'isomérisation, les interactions avec les deux premiers partenaires sont perdues, tandis que His149 et l'oxygène du phénolate restent liés à l'hydrogène, ce qui entraîne une conformation trans du chromophore qui est une image miroir de la conformation cis (Fig. 2b). Ce mécanisme très inhabituel fait que le chromophore hors état de rsFolder reste étroitement attaché à l'échafaudage du baril et explique probablement sa stabilité thermique exceptionnelle. Le nombre limité de résidus impliqués dans la commutation marche-arrêt de rsFolder et la cascade réduite de formation et de perturbation des liaisons H qui l'accompagne pourraient entraîner une barrière d'énergie plus élevée pour la transition de marche à arrêt dans rsFolder que dans rsEGFP2.

Les structures cristallographiques de rsEGFP2 et rsFolder dans leurs états activé et désactivé fournissent une base moléculaire claire pour la stabilité thermique plus élevée observée de l'état désactivé de rsFolder. Le contraste de commutation réduit de rsFolder est plus difficile à expliquer en termes structurels. La symétrie unique observée entre les états activé et désactivé de rsFolder pourrait éventuellement jouer un rôle. Les données structurelles révèlent également le rôle central de l'acide aminé en position 146 dans la différenciation des mécanismes de commutation des deux RSFP et suggèrent une stratégie simple pour faire évoluer rationnellement le mécanisme de rsFolder vers celui de rsEGFP2 - c'est-à-dire remplacer son Phe146 par une tyrosine. Le mutant F146Y de rsFolder, appelé rsFolder2, a donc été produit et caractérisé. Comme prévu, rsFolder2 affiche un contraste de commutation plus élevé (Fig. 1a, Fig. S4) et une stabilité thermique réduite pour son état désactivé par rapport à rsFolder (Fig. 1f), rapprochant ainsi son comportement photophysique de celui de rsEGFP2. Parallèlement, la maturation (Fig. 1d) et la cinétique de repliement héritées de Superfolder-GFP sont essentiellement préservées dans rsFolder2 (Fig. 1d, e). Au total, ces propriétés (changement de contraste, photorésistance, maturation et repliement) suggèrent que rsFolder2 pourrait être un candidat approprié pour l'imagerie à l'échelle nanométrique du périplasme bactérien, en utilisant la microscopie RESOLFT.

Ayant établi que rsFolder et rsFolder2 sont à la fois des RSFP à commutation rapide et résistantes à la photofatigue et qu'elles se replient, in vitro, aussi bien que Superfolder-GFP, nous nous sommes demandé si elles pouvaient se replier et se photoswitcher dans le contexte cellulaire, c'est-à-dire lorsqu'elles sont exprimées dans le cytosol (vecteur pET15-b) ou le périplasme (vecteur pET26-b(+), voie Sec) des cellules d'E. coli. La luminosité des cellules bactériennes, exprimée ici comme le rapport entre le signal de fluorescence (à 505 nm) et la densité optique (à 600 nm), renseigne sur la quantité totale de FP repliées présentes dans les cellules vivantes. Par rapport à l'expression cytosolique, tous les clones présentaient une luminosité cellulaire bactérienne inférieure dans les tests d'expression périplasmique, l'effet le plus spectaculaire étant observé sur les cellules exprimant rsEGFP2 (Fig. S9a). La figure 3 montre que les cultures exprimant rsEGFP2 dans le périplasme meurent prématurément, probablement en raison de l'accumulation et du dépôt de protéines dépliées en agrégats toxiques. En revanche, l'expression périplasmique de rsFolder et rsFolder2 n'affecte pas la viabilité cellulaire (Fig. 3a). La luminosité réduite des cellules exprimant rsFolder et rsFolder2 périplasmiques provient probablement du volume intrinsèquement plus petit du périplasme et de sa charge protéique globale régulée. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons séparé le contenu périplasmique et cytosolique des cellules et évalué la quantité de RSFP présente dans chaque compartiment par fluorimétrie et électrophorèse sur gel (Fig. S9b). Les résultats soutiennent l'hypothèse selon laquelle la quantité de protéines pouvant être adressée au périplasme est en effet limitée. Incidemment, ils confirment également que la fluorescence observée provient principalement (~ 70%) des RSFP périplasmiques. Il est important de noter que les expériences de commutation réalisées sur des cellules cultivées sur un milieu solide confirment que les efficacités de commutation de rsFolder et rsFolder2 sont préservées dans le contexte cellulaire (Fig. 3b et Fig. S4). Les données montrent également que la résistance à la photofatigue est similaire lorsque les RSFP sont adressés au périplasme.

Expressions cytoplasmiques et périplasmiques et fatigue de commutation.

( a ) La croissance bactérienne d'une seule colonie dans un milieu d'auto-induction et d'autres expressions cytoplasmiques et périplasmiques de rsFolder, rsFolder2 et rsEGFP2 ont été surveillées en absorbance (rouge) et en fluorescence (noir), respectivement, pendant 20 heures. Les barres d'erreur représentent les écarts types sur des mesures en triple. La production de rsEGFP2 ciblée sur le périplasme correspond à un arrêt brutal de la croissance bactérienne qui s'explique par une toxicité cellulaire induite par le colmatage périplasmique. ( b ) Commutation des mesures de fatigue de rsFolder et rsFolder2 par rapport à rsEGFP2, exprimées dans le cytoplasme ainsi que dans le périplasme des cellules vivantes d'E. coli. Les points noirs indiquent la fluorescence maximale à l'état passant de chaque cycle de commutation. Les courbes de décroissance exponentielle ajustées correspondantes sont indiquées en rouge. Les lignes pointillées illustrent le nombre de cycles que les différents échantillons RSFP peuvent réaliser avant d'être blanchis à la moitié de leur fluorescence initiale.

Nous avons déterminé si rsFolder et rsFolder2 pouvaient être utilisés pour l'imagerie. Tout d'abord, nous avons imagé des cellules exprimant rsEGFP2, rsFolder ou rsFolder2 dans le cytosol ou le périplasme par imagerie à champ large (Fig. 4a). Les cellules exprimant les RSFP dans le cytosol présentent une distribution de fluorescence homogène, tandis que des périplasmes clairement délimités sont visibles sur les images de cellules exprimant rsFolder périplasmique ou rsFolder2. Sans surprise, les cellules exprimant rsEGFP2 périplasmique montrent un signal difficilement détectable et aucune délimitation du périplasme.

Imagerie grand champ et RESOLFT.

( a ) Images représentatives à large champ de bactéries E. coli fixes exprimant rsEGFP2, rsFolder et rsFolder2 soit dans le cytoplasme, soit dans le périplasme. Toutes les images ont été obtenues en utilisant les mêmes conditions d'éclairage et mises à l'échelle sur la même plage dynamique. Barre d'échelle : 2 μm. ( b ) Imagerie RESOLFT de bactéries E. coli vivantes exprimant rsFolder2 dans le périplasme et images confocales à diffraction limitée correspondantes. ( c ) Les graphiques I à IV illustrent les profils de ligne à travers le périplasme aux emplacements indiqués par les flèches en ( b ). Chaque profil est une moyenne de cinq lignes adjacentes distantes de 30 nm. Barre d'échelle : 1 μm

Nous avons ensuite effectué une microscopie RESOLFT sur des cellules E. coli exprimant rsFolder2 périplasmique. À partir des mesures des régions les plus étroites, nous avons dérivé une résolution d'environ 70 nm pour le périplasme (Fig. 4b, tracé linéaire I). Certaines bactéries présentaient des structures hétérogènes probablement dues à la présence de peptidoglycane et de protéines associées occupant l'espace périplasmique (Fig. 4b, tracés linéaires II-III). Nous avons également pu distinguer le périplasme de deux bactéries adjacentes séparées par une distance aussi courte que 110 nm (Fig. 4b, tracé linéaire IV), démontrant une amélioration significative de la résolution par rapport à l'imagerie limitée par la diffraction. Une résolution similaire (80 nm) a été obtenue dans les contrôles où une fusion de rsFolder2 avec la kératine18 a été exprimée dans le cytosol des cellules HeLa pour évaluer ses performances RESOLFT (Fig. S10) 15,16. Les micrographies RESOLFT montrent que l'épaisseur du périplasme varie considérablement d'une cellule à l'autre (Fig. 4b). Nous corrélons cette observation avec des micrographies électroniques, qui révèlent que le périplasme est généralement plus grand dans les cellules isolées (jusqu'à des centaines de nm) que dans les cellules de la colonie (quelques dizaines de nm) (Fig S11a). La nature hétérogène du périplasme et l'amélioration de la résolution permise par rsFolder2 sont en outre mises en évidence par la visualisation de ce qui pourrait être des événements de bourgeonnement de la membrane externe et la formation de vésicules dans les images RESOLFT (indiquées par des flèches sur la Fig. S11b, c)38. Les micrographies électroniques à transmission révèlent les mêmes caractéristiques (Fig. S11b). Ainsi, nos résultats ouvrent la porte à l'imagerie super-résolution de fluorescence en direct de processus complexes périplasmiques et de la membrane externe jusqu'ici traçables uniquement par microscopie électronique.

Les rsFolders sont les deux premiers RSFP dotés de capacités de repliement oxydatif. Nous avons montré que les deux sont capables de se replier et de photocommuter dans le périplasme bactérien et que rsFolder2 peut être utilisé pour obtenir des images de sous-diffraction RESOLFT. Il reste à déterminer si les rsFolders peuvent être utilisés dans d'autres compartiments cellulaires procaryotes ou eucaryotes où le repliement oxydatif a lieu, y compris le réticulum endoplasmique, les membranes thylakoïdes, l'espace intermembranaire mitochondrial et le milieu externe39. Malgré sa faible luminosité, le mutant de deuxième génération rsFolder2 affiche un contraste de commutation amélioré par rapport à rsFolder, ce qui en fait un candidat bien adapté pour RESOLFT. Nous prévoyons que cette variante pourrait également être utile pour d'autres techniques telles que l'activation non linéaire à motifs SIM40 ou pcSOFI6 pour l'imagerie des protéines périplasmiques dans les cellules vivantes. rsFolder n'est pas adapté à l'imagerie RESOLFT mais peut s'avérer utile pour d'autres approches de super-résolution, telles que pcSOFI ou des méthodes potentielles tirant parti de son extrême stabilité à l'état désactivé. Un réglage plus fin des propriétés photophysiques de l'échafaudage des rsFolders peut être envisagé, pour mieux l'adapter à d'autres techniques de super-résolution. Par exemple, des variantes de rsFolder à commutation lente et/ou à décalage vers le rouge pourraient être développées pour la microscopie de localisation d'une seule molécule et/ou l'imagerie multicolore. Spécifique à l'imagerie RESOLFT, rsFolder2 pourrait être évolué pour augmenter la résolution atteignable, soit rationnellement, soit par évolution dirigée. Que de telles améliorations soient ou non à portée de main sera déterminé par de futures recherches.

Des cellules E. coli DH5α ont été utilisées pour le clonage et l'amplification de l'ADN tandis que E. coli BL21 (DE3) a été utilisée pour l'expression. Sauf indication contraire, toutes les cultures bactériennes ont été cultivées dans du milieu LB additionné de 100 μg/ml d'ampicilline (cytoplasmique rsFolder, rsFolder2 et rsEGFP2) ou 30 μg/ml de kanamycine (cytoplasmique Superfolder-GFP et périplasmique rsFolder, rsFolder2 et rsEGFP2). Les produits chimiques ont été achetés chez Sigma-Aldrich.

Les plasmides Superfolder-GFP/pET-30 et rsEGFP2/pQE31 ont été gracieusement fournis par le Dr Cécile Morlot et le Prof. Stefan Jakobs, respectivement. rsFolder a été conçu sur la base de la structure de Superfolder-GFP, en introduisant dans la séquence les quatre mutations clés de rsEGFP2 par rapport à EGFP (T65A, Q69L, A163S et V206K). La séquence, synthétisée par Eurofins MWG Operon, a été optimisée de manière récursive en codons pour les expressions humaines et E. coli et une séquence Kozak a été insérée pour une expression potentielle dans des cellules de mammifères. Les sites de restriction les plus courants ont été supprimés de la séquence codante résultante pour faciliter d'autres utilisations de clonage. rsFolder2 a été obtenu par mutagenèse dirigée, en utilisant la matrice rsFolder et est un mutant à point unique de rsFolder (F146Y). Pour les tests d'expression cytosolique, rsEGFP2, rsFolder et rsFolder2 ont été sous-clonés dans pET-15b (entre les sites de restriction NdeI et BamHI). Pour les tests d'expression périplasmique, les protéines ont été sous-clonées dans pET-26b(+) en utilisant la méthode d'assemblage de Gibson41. L'ADN plasmidique et les fragments de PCR ont été purifiés avec un kit Qiaprep spin miniprep (Qiagen) et un kit de purification Qiaquick PCR (Qiagen), respectivement. Le plasmide codant pour la protéine de fusion kératine18-rsFolder2 a été généré en remplaçant la séquence codante de TagRFP par celle de rsFolder2 (sites de restriction : KpnI et NotI) dans le vecteur commercial pTagRFP-kératine (Evrogen, Moscou, Russie).

Des protéines fluorescentes fusionnées à une étiquette polyhistidine N-terminale ont été exprimées dans des cellules E. coli BL21 (DE3). Après lyse cellulaire, les protéines fluorescentes ont été purifiées par chromatographie d'affinité Ni-NTA suivie d'une chromatographie d'exclusion de taille à l'aide d'une colonne HiLoad 16/600 Superdex 75 (GE Healthcare, Fribourg, Allemagne). Les protéines purifiées ont été concentrées par ultrafiltration et équilibrées dans des solutions tampons (HEPES 50 mM pH 7,5). Des cristaux de rsEGFP2 et rsFolder ont été obtenus par la méthode de diffusion de vapeur en goutte suspendue à 20 ° C. En bref, la protéine (12 mg/ml pour rsEGFP2 et 10 mg/ml pour rsFolder) et la solution précipitante (HEPES 0,1 M pH 8,1, sulfate d'ammonium 1,7 M pour rsEGFP2 et Tris 0,1 M pH 8,5, 20 % PEG 3 350 pour rsFolder) ont été mélangées dans un rapport de 1 :1, ce qui a donné des gouttes de 2 μl qui ont été placées sur un flacon de 1 ml. puits contenant la solution précipitante. Les cristaux sont apparus en 1 à 7 jours.

Avant la collecte de données, les cristaux de rsEGFP2 et de rsFolder dans leurs états activés ont été cryoprotégés par un court trempage dans la liqueur mère additionnée de 15 % de glycérol, suivi d'un refroidissement éclair dans de l'azote liquide. Afin de générer les états désactivés, les cristaux ont été éclairés pendant environ 1 min avec un laser à 488 nm couplé à une fibre après cryoprotection et avant refroidissement éclair dans de l'azote liquide. Les ensembles de données de diffraction des rayons X ont été collectés à 100K à l'European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) sur les lignes de lumière ID23-242 (rsEGFP2) et ID2943 (rsFolder), équipées respectivement d'un détecteur PILATUS 2M et PILATUS 6M. Les données ont été traitées, fusionnées et mises à l'échelle à l'aide de XDS/XSCALE et des facteurs d'amplitude ont été générés à l'aide de XDSCONV44. Les structures ont été mises en phase par la méthode de remplacement moléculaire en utilisant comme modèle de départ la structure aux rayons X de Superfolder-GFP (PDB ID : 2B3P) et le programme PHASER45. La construction du modèle a été réalisée avec Coot46. La minimisation de l'énergie et le raffinement individuel du facteur B ont suivi chaque étape de la reconstruction manuelle. Le raffinement et les calculs cartographiques ont été effectués à l'aide de REFMAC47 et PHENIX48. La collecte de données et les statistiques de raffinement sont présentées dans le tableau 2. Les chiffres ont été produits à l'aide de PyMOL49.

Des expériences de vitesse de sédimentation ont été réalisées dans une ultracentrifugeuse analytique XL-I (Beckman Coulter, USA), avec une vitesse de rotor de 42 000 tr/min, à 20 °C, en utilisant un rotor AnTi-50. Selon leurs concentrations, des échantillons de 55, 110 ou 420 μl ont été respectivement chargés dans des pièces maîtresses à double secteur en Ti de 1,5, 3 ou 12 mm de longueur de trajet équipées de fenêtres en saphir (Nanolytics GmbH, Allemagne). Le solvant et les tampons de référence étaient HEPES 50 mM pH 7,5 ; NaCl 150 mM. Des balayages radiaux à 280, 488 ou 395 nm et à partir d'optiques interférentielles ont été surveillés. Les données ont été traitées à l'aide de méthodes standard telles qu'implémentées dans le logiciel Sedfit, v14.6e (www.analyticalultracentrifugation.com) pour l'analyse des données. Les paramètres du tampon (en particulier, le coefficient de sédimentation à 20 °C, s20w) ont été calculés à l'aide du programme Sednterp (sednterp.unh.edu) et en supposant une densité (ρ) et une viscosité (η) de 1,008 g.ml-1 et 1,05 mPa.s, respectivement. Les profils de vitesse de sédimentation ont été analysés à la fois en termes de distribution continue c(s) des coefficients de sédimentation (s)50 et dans le cadre du modèle des espèces non interagissantes, fournissant des valeurs expérimentales pour s et la concentration, d'une part, et la masse molaire M, d'autre part. Le volume spécifique partiel prévu et l'incrément d'indice de réfraction (∂n/∂c) étaient de 0,733 ml.g-1 et 0,189 pour rsFolder et de 0,735 ml.g-1 et 0,190 pour rsEGFP2, indiquant que les deux protéines sédimentent sous forme de monomères. Les figures ont été produites à l'aide de Gussi v1.0.9e (biophysics.swmed.edu/MBR/software.html).

Les spectres d'absorption ont été enregistrés à l'aide d'un photospectromètre Jasco V-630 UV/VIS (Easton, USA). Les spectres d'excitation (λem = 540 nm) et d'émission (λex = 480 nm) ainsi que les cinétiques de repliement, de maturation et d'expression ont été enregistrés à l'aide d'un lecteur de microplaques Biotek Synergy H4 (Winooski, VT, USA). Les spectres d'émission ont été obtenus en utilisant une excitation à 480 nm tandis que les spectres d'excitation ont été obtenus en mesurant la fluorescence à 540 nm. Les coefficients d'extinction molaire ont été déterminés à l'aide de la méthode de Ward51. Les rendements quantiques de fluorescence ont été calculés par rapport à la fluorescéine (ΦFL = 0,95) et validés entre les protéines en utilisant la méthode décrite par Williams et al. (9.0–9.5)]. Les stabilités thermiques des RSFP éteints ont été mesurées en surveillant l'absorption en fonction du temps, toutes les 10 minutes pendant 1 à 5 jours. Les récupérations de fluorescence photoinduite des FP éteints ont été mesurées à 20 ° C avec un spectromètre à base de CCD (AvaSpec-ULS2048, Avantes, Eerbeek, Pays-Bas) couplé à des fibres optiques à un porte-cuve. Les protéines diluées (50 μl) ont été placées dans une cuvette à 3 fenêtres de 50 μl et un diffuseur carré (Thorlabs, ED1-S50) a été placé devant la cuvette pour assurer des excitations laser homogènes à 488 nm (1,9 mW/cm2) et 405 nm (2,2 mW/cm2). L'émission de fluorescence a été mesurée toutes les 2 s (λem = 506 ± 4 nm pour rsEGFP2, rsFolder et rsFolder2 ; λem = 512 ± 4 nm pour Superfolder-GFP).

Une illumination constante à 488 nm a servi à la fois à éteindre les protéines et à exciter leur fluorescence tandis qu'une illumination alternée à 405 nm a été utilisée pendant 150 secondes toutes les 600 secondes pour favoriser les récupérations off-to-on. Les évolutions du signal de fluorescence ont ensuite été analysées avec MATLAB (The MathWorks Inc., Natick, Massachusetts, USA) dans le cadre de la méthode décrite dans Duan et al.53, permettant un calcul précis des rendements quantiques de commutation.

Toutes les protéines ont été diluées à 0,1 mg/ml dans un tampon de dénaturation (chlorhydrate de guanidine 8 M, DTT 1 mM, HEPES 50 mM pH 7,5) et chauffées pendant 10 minutes à 65 °C. De manière surprenante, un traitement par de l'urée concentrée sans chauffage n'a pas été suffisant pour déplier correctement ces protéines fluorescentes. Les protéines dénaturées ont ensuite été diluées 10 fois dans un tampon de renaturation (35 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 50 mM Tris pH 7,5, 30 % glycérol). Pour chaque protéine, la cinétique de repliement a été mesurée en suivant la récupération de fluorescence à 25 °C (λem = 485 ± 9 nm pour toutes les protéines ; λem = 505 ± 9 nm pour rsFolder, rsFolder2 et rsEGFP2 et à λem = 510 ± 9 nm pour Superfolder-GFP) toutes les minutes pendant 20 minutes. Les points de données ont été ajustés le long du temps t avec la fonction avec k, le taux de repliement ; tm, le temps médian de repliement ; et le paramètre de retard dérivé obtenu par . Toutes les expériences ont été réalisées en triple.

La cinétique de maturation a été mesurée selon un protocole adapté de Moore et al.54 Brièvement, 50 ml de cultures bactériennes ont été cultivées en milieu LB dans des flacons de 250 ml jusqu'à une densité optique de 0,6 puis transférées dans des tubes scellés de 50 ml. Cela a permis de créer un environnement anaérobie qui permet l'expression des protéines mais arrête la division cellulaire et la maturation des chromophores. Les protéines ont été exprimées pendant une nuit à température ambiante après induction à l'IPTG (1 mM). A 4 °C, les cellules ont ensuite été récoltées par centrifugation, remises en suspension dans 5 ml de tampon de lyse (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 mM, 1 comprimé de cocktail anti-protéase additionné de DNAseI) et lysées par sonication. Après centrifugation, 50 µL de surnageant ont été ajoutés à 200 µL de tampon de réoxygénation (35 mM KCl, 2 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl pH 7,5). Les intensités de fluorescence ont été enregistrées à 37 °C toutes les 10 minutes pendant environ 8 heures. Toutes les expériences ont été réalisées en triple.

Pour assurer un démarrage synchronisé de l'expression des protéines et pour garantir qu'aucune absorbance ou fluorescence détectable n'était présente au début de l'expérience, les bactéries ont été cultivées dans un milieu auto-inductible pour ces tests d'expression. En bref, pour chaque clone, une seule colonie bactérienne a été utilisée pour inoculer 5 ml de milieu de croissance d'auto-induction55 à 25 ° C, ensuite répartis dans des plaques à 96 puits avec 100 μl par puits. Les bactéries ont été cultivées en utilisant du glucose comme source de carbone jusqu'à ce qu'une DO de 0,6 soit atteinte (~ 8 heures), après quoi l'expression des protéines a été initiée en passant au lactose comme source de carbone et à la fois la DO (600 nm) et la fluorescence (505 nm) ont été surveillées en fonction du temps. La luminosité des cellules bactériennes a été exprimée comme le rapport entre la valeur de fluorescence et la DO après 20 h de croissance. Les niveaux d'expression cytoplasmique et périplasmique ont ensuite été quantifiés par fractionnement bactérien, comme décrit précédemment56. En bref, les cultures bactériennes induites ont été culottées à 3 000 g pendant 10 min à 4 ° C, remises en suspension dans 0, 5 ml de tampon TSE (Tris-HCl 200 mM pH 8, saccharose 500 mM et EDTA 1 mM) et incubées sur de la glace pendant 30 minutes. 0,5 ml d'eau glacée a été ajouté et incubé pendant 30 min. Les cellules ont été culottées et le surnageant a été recueilli sous forme de fraction périplasmique. Le culot a été remis en suspension dans 5 ml de réactif d'extraction de protéines BugBuster (Novagen 70921-3) et encore incubé pendant 30 minutes à température ambiante. Les lysats ont ensuite été centrifugés à 16 000 g pendant 45 min à 4 ° C et le surnageant a été collecté sous forme de fraction cytoplasmique. Les fractions bactériennes ont été chargées sur des gels d'acrylamide à 12 % SDS-PAGE et visualisées à l'aide de bleu de Coomassie. Pour quantifier les protéines repliées dans chaque compartiment, les fractions périplasmiques et cytoplasmiques ont été diluées 10 fois dans HEPES (pH 7,5) et les intensités de fluorescence ont été enregistrées.

Des mesures de fatigue de commutation sur des colonies vivantes d'E. La lumière a été focalisée par un objectif 20 fois (NA = 0,4) sur une colonie, fournissant des densités de puissance d'environ 0,5 kW/cm2 (488 nm) et d'environ 0,1 kW/cm2 (405 nm). Pour chaque RSFP, l'éclairage a été maintenu aussi court que nécessaire pour atteindre 100 % de photocommutation. La fluorescence a été enregistrée avec un PMT (tube photomultiplicateur).

Les cultures bactériennes ont été cultivées dans un milieu TB additionné de 1 % de glycérol jusqu'à une DO de 0,6, puis induites avec de l'IPTG pendant une nuit à 20 °C. Après induction, les cellules ont été culottées, fixées (pour l'imagerie grand champ) ou non (pour l'imagerie RESOLFT) avec 4% de paraformaldéhyde puis lavées deux fois avec du PBS. Une goutte de la suspension cellulaire a été déposée sur des lamelles de verre préalablement recouvertes de chitosane (pour l'imagerie à champ large) ou de gélose LB (pour l'imagerie RESOLFT) et montées sur des lames de verre.

Pour les expériences sur les cellules de mammifères, les cellules HeLa ont été ensemencées sur des lames de couverture pendant la nuit. La transfection a été effectuée à l'aide de Turbofect (ThermoFisher Scientific) conformément au manuel du fabricant. Après 1 jour d'incubation, les cellules ont été collées sur des lames d'objet avec du silicone picodent twinsil (Pcodent, Wipperfürth, Allemagne), empêchant la mort et ensuite imagées.

Des expériences d'imagerie à grand champ ont été réalisées sur un microscope inversé IX81 Olympus équipé d'un objectif à immersion dans l'huile 100X d'ouverture numérique 1,49 et d'un porte-objectif NPS anti-dérive (Olympus). Les échantillons ont été éclairés par un faisceau laser à polarisation circulaire de 488 nm (Spectra-Physics, Santa Clara, États-Unis) de 300 μW, 23, 5 μm FWHM de forme gaussienne.

La microscopie RESOLFT a été réalisée à l'aide d'un microscope Quad P (Abberior Instruments, Goettingen, Allemagne), équipé d'un objectif à immersion dans l'huile 100X d'une ouverture numérique de 1,4. Les images RESOLFT ont été enregistrées en appliquant la séquence d'éclairage suivante à chaque position de balayage : le premier rsFolder2 a été commuté à l'état activé en éclairant avec une lumière de 405 nm (30 μs à 2,2 à 2,5 μW). Deuxièmement, un faisceau en forme de beignet de lumière de 488 nm (640 à 670 μs à 14 μW) a été utilisé pour basculer les protéines à la périphérie de la tache focale dans l'état désactivé. Troisièmement, le signal fluorescent des protéines à l'état résiduel au centre du spot a été enregistré à 510 nm après excitation par une lumière à 488 nm (10 à 30 μs à 5 à 7 μW). Avant et après la coupure avec le faisceau en forme de beignet, de courtes pauses d'éclairage (jusqu'à 60 μs) ont été introduites dans la séquence de commutation. La taille du pas de balayage a été fixée à 30 nm. Des informations détaillées concernant le paramètre d'imagerie sont fournies dans le tableau S2.

La microscopie électronique à transmission a été utilisée pour visualiser les cellules E. coli BL21 DE3 cultivées dans l'interstice entre le milieu solide LB-agar et une grille de microscopie électronique57,58. En bref, les cellules ont été cultivées pendant une nuit jusqu'à une densité optique d'environ 1 à 600 nm. 20 μL de cellules diluées dix fois ont été déposées sur du milieu LB-agar, incubées pendant 1 h à 37 °C, avant d'y ajouter une grille de microscopie électronique. Les plaques ont été incubées pendant 3 heures supplémentaires à 37°C. Les grilles EM ont ensuite été retirées doucement, lavées 6 fois avec une goutte d'eau stérile, puis imagées directement ou après avoir été soumises à une coloration négative avec du silicotungstate de sodium à 2 % (p/v). Les images ont été prises dans des conditions de faible dose avec un microscope électronique CM12 et Tecnai 12 LaB6 fonctionnant à 120 kV et avec des grossissements nominaux de 22 000X et 45 000X à l'aide d'une caméra CCD Orius TM SC1000 de Gatan.

Comment citer cet article : El Khatib, M. et al. Conception rationnelle de protéines fluorescentes ultrastables et photocommutables de manière réversible pour l'imagerie à super-résolution du périplasme bactérien. Sci. Rep. 6, 18459; doi : 10.1038/srep18459 (2016).

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Ce travail a utilisé les plateformes du Grenoble Instruct Center (ISBG : UMS 3518 CNRS-CEA-UJF-EMBL) avec le soutien du FRISBI (ANR-10-INSB-05-02) et du GRAL (ANR-10-LABX-49-01) au sein du Partenariat de Grenoble pour la Biologie Structurale (PSB). Le soutien de ce travail provient de l'Agence Nationale de la Recherche (ANR-2011-BSV5-012-01 NOBLEACH à DB et ANR-12-BS07-0008-03 Multiclick à JPC) et de l'Université Grenoble Alpes (AGIR NanOxyd à VA). Tim Grotjohann et Stefan Jakobs de l'Institut Max Plank de chimie biophysique de Göttingen sont chaleureusement remerciés pour l'acquisition et le traitement des données des images RESOLFT ainsi que pour des discussions approfondies. Nous sommes redevables à Aline Le Roy et Christine Ebel de la plateforme ISBG PAOL pour la réalisation des expériences analytiques d'ultracentrifugation et le traitement des données, respectivement et à Daphna Fenel pour la collecte des micrographies électroniques. La plateforme de microscopie électronique est soutenue par la Région Rhône-Alpes, la Fondation Recherche Médicale (FRM), le Fonds Européen de Développement Régional (FEDER), le CNRS, le CEA, l'Université de Grenoble, l'EMBL et le GIS-Infrastrutures en Biologie, Santé et Agronomie (IBISA). Nous remercions sincèrement Martin Byrdin et Duan Chenxi pour leur aide dans la mesure des cycles de photocommutation en solution pour les protéines étudiées dans ce travail. Nous remercions Martin Weik pour la relecture du manuscrit et son soutien continu. Nous sommes reconnaissants à l'ESRF pour le temps de faisceau dans le cadre des projets à long terme MX1464, MX1583 et MX1676 (IBS BAG). Soutien financier du CEA, du CNRS et de l'Univ. Grenoble Alpes. MEK est soutenu par un doctorat. bourse de l'Alliance de Grenoble pour la biologie cellulaire structurale intégrée (GRAL) et du Commissariat à l'énergie atomique (CEA).

Univ. Grenoble Alpes, IBS, F-38044, Grenoble, France

Mariam El Khatib, Alexandre Martins, Dominique Bourgeois, Jacques-Philippe Colletier & Virgile Adam

CNRS, IBS, F-38044, Grenoble, France

Mariam El Khatib, Alexandre Martins, Dominique Bourgeois, Jacques-Philippe Colletier & Virgile Adam

CEA, IBS, F-38044, Grenoble, France

Mariam El Khatib, Alexandre Martins, Dominique Bourgeois, Jacques-Philippe Colletier & Virgile Adam

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Recherche conçue par MEK, JPC et VA. Échantillons préparés par MEK, ADM et VA ; MEK et VA ont effectué des expériences biochimiques et photophysiques et ont traité les données ; MEK et VA ont effectué des expériences d'imagerie ; MEK, JPC et VA ont traité des données cristallographiques ; MEK et VA ont affiné les structures ; MEK, DB, JPC et VA ont analysé les données ; DB et JPC ont rédigé le manuscrit avec les contributions de tous les auteurs.

Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.

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Réimpressions et autorisations

El Khatib, M., Martins, A., Bourgeois, D. et al. Conception rationnelle de protéines fluorescentes ultrastables et photocommutables de manière réversible pour l'imagerie à super-résolution du périplasme bactérien. Sci Rep 6, 18459 (2016). https://doi.org/10.1038/srep18459

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Reçu : 28 octobre 2015

Accepté : 11 novembre 2015

Publié: 06 janvier 2016

DOI : https://doi.org/10.1038/srep18459

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