Contrôle de la spéciation de l'anammox et de la stratégie de fixation du biofilm à l'aide de N

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 21720 (2022) Citer cet article

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L'élimination conventionnelle de l'azote dans le traitement des eaux usées nécessite un apport élevé en oxygène et en énergie. L'oxydation anaérobie de l'ammonium (anammox), la conversion en une seule étape de l'ammonium et du nitrite en azote gazeux, est une alternative plus énergétique et plus rentable appliquée largement au traitement des eaux usées secondaires. Ce serait également une option de traitement courante si la diversité et la physiologie des espèces étaient mieux comprises. Les bactéries Anammox ont été enrichies jusqu'à 80 %, 90 % et 50 % d'abondance relative, à partir d'un seul inoculum, dans des conditions d'enrichissement standard avec des augmentations progressives de la concentration de nitrite et d'ammoniac (R1), une supplémentation en oxyde nitrique (R2) ou du carbone organique complexe provenant des eaux usées principales (R3), respectivement. Candidatus Brocadia caroliniensis prédominait dans tous les réacteurs, mais un déplacement vers Ca. Brocadia sinica s'est produit à des concentrations d'ammonium et de nitrite > 270 mg NH4–NL−1 et 340 mg NO2–NL−1 respectivement. En présence de NO, la croissance hétérotrophe a été inhibée et Ca. Jettenia a coexisté avec Ca. B. caroliniensis avant de diminuer à mesure que les nitrites augmentaient à 160 mg NO2–NL−1. La supplémentation en carbone organique a conduit à l'émergence de communautés hétérotrophes qui ont co-évolué avec Ca. B. caroliniensis. Californie. B. caroliniensis et Ca. Jettenia forme préférentiellement des biofilms sur les surfaces, alors que Ca. Brocadia sinica forme des granules en suspension. Nos résultats indiquent que plusieurs espèces de bactéries anammox coexistent et occupent des sous-niches dans les réacteurs anammox, et que la population dominante peut être déplacée de manière réversible, par exemple en modifiant la charge d'azote (c'est-à-dire qu'une concentration élevée en nitrite favorise Ca. Brocadia caroliniensis). La spéciation a des implications pour la conception des procédés de traitement des eaux usées, où la stratégie d'immobilisation cellulaire optimale (c'est-à-dire les porteurs par rapport aux granulés) dépend de l'espèce dominante.

L'oxydation anaérobie de l'ammonium (anammox), combinée à la nitritation partielle, est largement appliquée pour traiter les eaux usées riches en azote et déficientes en carbone (par exemple, traitement secondaire) en raison d'importantes économies d'énergie par rapport aux procédés conventionnels. Il a également été proposé comme option de traitement durable pour le traitement des eaux usées municipales (c'est-à-dire le traitement principal). Dix-neuf espèces de bactéries candidatus anammox ont été identifiées dans divers environnements, y compris les zones marines suboxiques, les sédiments côtiers, les lacs et les usines de traitement des eaux usées. Celles-ci ont été classées en cinq genres candidats1,2,3, et bien que les bactéries anammox puissent coloniser divers systèmes naturels et artificiels, différents genres coexistent rarement dans le même habitat4. On pense que les différences de taux de croissance, d'affinités avec les substrats, de sensibilités aux composés inhibiteurs, de substrats de croissance préférés et de voies métaboliques différentielles contribuent à la spécialisation de niche1,5,6,7,8,9,10.

Des changements de population au niveau des espèces et des genres ont été signalés dans des réacteurs anammox à l'échelle du laboratoire dans diverses conditions9,10,11. Au cours de la mise à l'échelle du premier réacteur anammox commercial à grande échelle, la population dominante est passée de Ca. Kunenia stuttgartiensis à Ca. Brocadia anammoxidans, bien que les raisons n'en aient pas été fournies12. Des études ont rapporté que des conditions environnementales spécifiques dans les réacteurs de nitritation partielle/anammox (PN/A) ne peuvent sélectionner qu'une seule espèce de bactérie anammox11,13. Par exemple, Ca. Jettenia moscovienalis2, Ca. B. caroliniensis14 et Ca. B. sinica13 ont été détectés dans des réacteurs secondaires distincts traitant la liqueur de digesteur anaérobie, tandis que Ca. Brocadie. sp. 40 a été identifiée comme la bactérie anammox dominante dans les conditions dominantes15. Park et al.11 ont montré que la composition des aliments est plus importante dans la sélection des bactéries anammox que la configuration de l'inoculum et du réacteur. Néanmoins, il n'y a pas de consensus apparent sur les facteurs qui sélectionnent une espèce de bactérie anammox plutôt qu'une autre.

L'élucidation des facteurs qui enrichissent pour des espèces spécifiques de bactéries anammox avec des propriétés cinétiques et physiologiques spécifiques améliorerait potentiellement la conception et les performances du procédé. Les bactéries Anammox existent dans une gamme de conditions, telles que les systèmes PN/A latéraux et principaux avec des concentrations élevées et faibles d'ammonium/nitrite respectivement, et de nombreux facteurs sont probablement impliqués dans la sélection des espèces. Bien que le nitrite (NO2-) soit toxique pour les bactéries, il peut également agir comme accepteur d'électrons pour l'oxydation de l'ammonium et comme donneur d'électrons pour la réduction du bicarbonate en biomasse. Il exerce ainsi une pression de sélection des espèces de bactéries anammox en fonction de leurs capacités à l'utiliser et à la tolérer. Une réduction de 50 % de l'activité de l'anammox a été rapportée chez les bactéries anammox exposées à des concentrations de NO2 entre 100 et 400 mg de NL−116,17,18. Alors que l'oxyde nitrique (NO), un oxydant puissant produit à partir du nitrite en tant qu'intermédiaire dans la voie biochimique de l'anammox19,20, est toxique, les bactéries anammox peuvent le tolérer à des concentrations plus élevées que de nombreuses bactéries21,22. En plus des pressions de sélection potentielles du nitrite et du NO, la capacité à consommer également des substrats organiques (c'est-à-dire l'acétate et le propionate) s'est avérée conférer des avantages compétitifs au Ca. B. fulgida et Ca. Anammoxoglobus propionicus respectivement, sur d'autres espèces, y compris les dénitrifiants6,7. Il reste à déterminer si la sélection de tels « chimioorganotrophes facultatifs » serait favorisée dans le milieu carboné organique complexe présent dans les conditions dominantes. Néanmoins, les bactéries anammox occupent des niches hautement spécialisées qui sont définies par plus que les seules concentrations d'ammonium et de nitrite.

La capacité d'améliorer l'activité d'espèces spécifiques de bactéries anammox avec des propriétés physiologiques et de croissance favorables est particulièrement avantageuse pour le démarrage et l'optimisation des procédés anammox industriels. Alors que les boues anammox secondaires établies sont couramment utilisées pour ensemencer ou bio-augmenter de nouvelles installations à grande échelle, l'inoculation à partir d'installations non anammox existantes à grande échelle pour démarrer des réacteurs anammox est un défi logistique11 et prend du temps en raison de la sensibilité du processus à la composition de l'alimentation, à l'oxygène12 et aux espèces microbiennes concurrentes23. Une rétention élevée de la biomasse est nécessaire dans les réacteurs anammox en raison des taux de croissance lents des bactéries anammox. Ceci peut être réalisé en favorisant l'agrégation de la biomasse dans des réacteurs anammox à base de biofilm24. La biomasse dans un réacteur anammox peut s'auto-assembler en flocs en suspension, films fixés sur des surfaces ou des supports, petits granulés, gros granulés ou une combinaison de toutes ces morphologies25. De tels agrégats peuvent jouer des rôles fonctionnellement différents dans le réacteur et même affecter les efficacités d'élimination de l'azote26,27. Comprendre quels facteurs déterminent la sélection des espèces et si différentes espèces assument des morphologies de biofilm particulières pourrait éclairer la conception des processus et les stratégies de contrôle pour obtenir une élimination plus stable de l'azote dans le large éventail de conditions de fonctionnement généralement rencontrées dans les bioréacteurs anammox28.

Ce travail vise à explorer comment la composition de la communauté anammox, la performance du processus et la morphologie du biofilm sont modifiées par des facteurs généralement rencontrés dans les systèmes anammox industriels (c. Il a été émis l'hypothèse que différentes compositions de substrat, simulant (a) des eaux usées déficientes en carbone organique avec des charges d'azote pour les eaux usées domestiques principales et secondaires (réacteurs R1) et avec (b) un stress oxydatif généralement rencontré dans les systèmes PN/A par l'exposition au NO (réacteur R2), ou (c) des eaux usées domestiques à forte COD:N (réacteur R3), pourraient sélectionner une communauté distincte, en particulier des espèces de bactéries anammox. Alors que certains de ces facteurs ont déjà été étudiés indépendamment17,29, cette étude examine ces facteurs sur la sélection des espèces de bactéries anammox à partir du même inoculum. Une meilleure compréhension de la façon dont l'abondance relative des espèces d'anammox peut être manipulée éclairera la conception du processus d'élimination de l'azote et pourrait contribuer à la compréhension de la répartition des niches dans les habitats microbiens/environnementaux complexes.

Les bactéries Anammox ont été enrichies avec succès dans toutes les conditions d'enrichissement testées, mais avec des temps de démarrage variables. La période de démarrage était la plus courte dans R2 complété par du NO et une activité anammox a été observée dans les 20 jours suivant l'inoculation, contre 39 jours pour R1, opéré dans des conditions d'enrichissement standard (Figs. 1A, B). En présence de carbone organique complexe dans R3, l'activité anammox n'a été détectée qu'après 50 jours de fonctionnement (Fig. 1C). Dans R1 et R2, les concentrations d'ammonium et de nitrite ont été augmentées à 280 mg NL-1 et 350 mg NL-1, respectivement (Fig. 1A, B), au-dessus desquelles l'activité de l'anammox a été inhibée. En plus de la période de démarrage plus courte, un temps de rétention hydraulique (HRT) plus court a été appliqué à R2 qu'à R1 en raison de taux d'élimination de N plus élevés de 1200 mg NL-1 jour-1 par rapport à 800 mg NL-1 jour-1 en fonctionnement stable (Fig. 1A, B). Malgré le taux de charge plus élevé, les concentrations de solides en suspension étaient comparables dans les deux réacteurs, indiquant une activité d'élimination de N spécifique plus élevée pour R2 que R1. Un taux de charge en N significativement inférieur de 121 ± 6 mg NL-1 jour-1 a été atteint dans R3. La concentration finale d'ammonium dans l'effluent a chuté régulièrement du jour 58 au jour 80, le réacteur affichant désormais une activité stable d'élimination de l'ammonium par les bactéries anammox. Le nitrite résiduel dans l'effluent a également diminué progressivement du jour 60 au jour 100 avec une diminution de la concentration d'ammonium (Fig. 1C). La demande chimique totale moyenne en oxygène (TCOD) et la demande chimique en oxygène soluble (sCOD) dans l'effluent étaient de 87 ± 9 mg L-1 et 51 ± 8 mg L-1, respectivement avec un taux d'élimination moyen de 520 mg L-1 jour-1 à partir du jour 300.

Démarrage et enrichissement de bactéries anammox à partir de boues activées alimentées avec (A) des eaux usées synthétiques avec ammonium et nitrites en R1, (B) des eaux usées synthétiques avec ammonium, nitrites et alimentation continue en monoxyde d'azote en R2, et (C) des effluents primaires additionnés de nitrites en R3. MLVSS (), Influent nitrite (NO2, ) et les taux de chargement d'azote (NLR, ) de chaque condition d'enrichissement sont indiqués dans le panneau supérieur de chaque graphique ; avec une abondance relative d'OTU de bactéries anammox dominantes affiliées à Ca. B. caroliniensis () et Ca. B. sinica () et les OTU de bactéries non anammox corrélées affiliées à Anaerolineaceae () et Fimbriimonadia () sont présentées dans les panneaux inférieurs de (A, B); Californie. Jettenia () a également été détecté dans R2 (B). Californie. B. caroliniensis, la seule bactérie anammox dominante dans R3, est représentée en (C) avec des OTU de bactéries non anammox corrélées affiliées à Comamonadaceae () et Ca. Aquirestis () dominant à un stade différent. L'abondance relative des bactéries anammox totales est mise en évidence sous la forme d'un graphique en aires () dans chaque graphique. Les lignes pointillées rouges indiquent les moments auxquels le biofilm d'anammox a été gratté de la paroi du réacteur en suspension. La communauté chimique et microbienne détaillée (avec OTU> 5% à tout moment analysé) peut être trouvée dans la Fig. S1 supplémentaire, Informations complémentaires.

Les communautés microbiennes de trois réacteurs ont été différenciées par jour de fonctionnement (R = 0,53, p = 0,007) et par l'utilisation de différents réacteurs, c'est-à-dire R1 vs R2 vs R3 (R = 0,38, p = 0,001). De plus, les communautés R1 et R2 à différents niveaux de N ont montré une dissemblance relativement forte (R = 0,48 et 0,57, respectivement, avec p = 0,001 pour les deux). Parallèlement à l'augmentation de l'activité anammox, un changement dans les bactéries anammox fonctionnelles a été observé dans R1 et R2 avec une augmentation de la charge de N, mais pas dans R3 où une faible charge de N a été maintenue. Le séquençage de l'amplicon du gène de l'ARNr 16S a montré que les bactéries anammox étaient en dessous de la limite de détection (< 0,018 %) au début de l'exploitation du réacteur pour les trois réacteurs. Dans R1 et R2, les unités taxonomiques opérationnelles (OTU) annotées aux bactéries anammox ont augmenté progressivement jusqu'à 80 % (jour 110) et 90 % (jour 95) de l'abondance relative des OTU, respectivement, à une concentration de nitrite dans l'influent > 200 mg N L-1 (Fig. 1A, B). Les communautés microbiennes de R1 et R2 à différents niveaux de niveau N ont montré une forte dissemblance relative (R = 0,48 et 0,57, respectivement, avec p = 0,001 pour les deux). La communauté microbienne en période de forte charge en N, en revanche, n'était pas très différenciée (R = 0,29, p = 0,003). Malgré l'augmentation de l'abondance relative de plusieurs OTU affiliées aux bactéries anammox dans R1 et R2, une seule OTU annotée Ca. Brocadia, identifié comme Ca. B. caroliniensis par analyse de bibliothèque de clones (Fig. 2), dominée tout au long des 120 premiers jours de fonctionnement du réacteur. Californie. B. caroliniensis a augmenté pendant l'enrichissement jusqu'à une abondance relative de 50 % dans R1 et R2. Cependant, une augmentation supplémentaire des concentrations d'ammonium et de nitrite dans l'influent au-delà de 220 mg NL-1 à partir du jour 100 (taux de charge en N de 500 mg NL-1-jour-1 pour R1 et de 750 mg NL-1-jour-1 pour R2) a entraîné une augmentation progressive de Ca. Brocadia_2, identifié comme Ca. B. sinica par analyse de bibliothèque de clones (Fig. 2).

Arbre phylogénétique basé sur les séquences d'ARNr 16S des principaux OTU (avec le suffixe "*") et des clones (avec le suffixe "**") issus du séquençage des amplicons et de l'analyse de la bibliothèque de clones, respectivement. Le nombre de colonies identiques par total de colonies prélevées est indiqué entre parenthèses, par exemple 34/40 indique 34 colonies identiques pour 40 colonies prélevées. L'arbre phylogénétique a été généré par ARB avec la base de données SILVA. Les séquences obtenues à partir de la bibliothèque de clones et du séquençage des amplicons ont été insérées dans l'arbre à l'aide de l'outil d'insertion de parcimonie d'ARB. Les séquences voisines les plus proches ont été sélectionnées pour générer l'arbre final avec la méthode de jointure voisine avec un bootstrap de 1000 réplications. La ligne pointillée indique la division de la famille Ca. Brocadiacées et genre Ca. Brocadie. Methanosaeta concilii a été sélectionné comme groupe externe. Seules les séquences identifiées les plus proches ont été sélectionnées pour être présentées. L'échelle indique 0,1 changement de nucléotide par position de nucléotide. Les affiliations de séquence et les abondances relatives des principales bactéries anammox étaient cohérentes entre le séquençage des amplicons et l'analyse de la bibliothèque de clones.

Une diminution de Ca. B. caroliniensis a également été observé (Fig. 1A, B). Au-delà de 180 jours de fonctionnement du réacteur, Ca. B. sinica a augmenté à 33 % et 42 % en abondance relative dans R1 et R2, respectivement, tandis que Ca. B. caroliniensis a diminué à moins de 10 % en abondance relative dans les deux réacteurs. En présence de carbone organique, Ca. B. caroliniensis était le taxon anammox le plus dominant tout au long du processus d'enrichissement dans R3 opéré à un faible taux de charge en N de 120 mg NL −1 jour −1 (Figs. 1C). Cependant, l'abondance relative des bactéries anammox totales était significativement plus faible dans R3 (~ 50%) que dans R1 et R2 (~ 80%), suggérant un environnement plus compétitif pour les bactéries anammox en présence de carbone organique. L'analyse par hybridation in situ fluorescente (FISH) (Fig. 3D – F) sur R1 (jour 80) et R2 (jour 675) a en outre indiqué que Ca. B. sinica dominait dans ces réacteurs tandis que Ca. B. caroliniensis est restée la seule bactérie anammox détectée dans R3 (jour 683). Les sondes FISH spécifiques aux espèces conçues ont servi à observer les changements de population graduels pendant le fonctionnement du réacteur en réponse aux changements des facteurs de contrôle.

Images de microscopie optique d'échantillons de biomasse en suspension montrant une structure granulaire dans R1 (A) et R2 (B) et une structure floconneuse dans R3 (C). Analyse FISH réalisée sur des granulés broyés pour confirmer la dominance de Ca. B. sinica (cyan) dans R1 (D) et R2 (E) et la prévalence de Ca. B. caroliniensis (magenta) en R3 (F) à la fin de la Phase III. Toutes les autres bactéries anammox sont en bleu. Les images FISH présentées ici sont représentatives de la culture. Les barres d'échelle de (A), (B) et (C) indiquent 1 mm, tandis que (D), (E) et (F) indiquent 1 µm.

Alors que d'autres OTU affiliées au genre Ca. Des brocadia ont également été détectés, leur abondance relative était inférieure à 10% (Fig. S1 supplémentaire). La présence de ces Ca. Les OTU de Brocadia sont probablement dues à différentes souches de Ca. Brocadia ou erreurs de séquençage car seules de faibles abondances relatives ont été détectées. A part Ca. Brocadia, OTU affiliées à Ca. Jettenia a émergé pour coexister avec Ca. B. caroliniensis uniquement dans R2 (avec apport continu de NO), suggérant que la présence de NO peut fournir un avantage compétitif pour Ca. Jettenia. Cependant, Ca. Jettenia a diminué avec l'augmentation du taux de chargement de N (c'est-à-dire après le jour 102).

Californie. Jettenia n'a été observée que dans R2 mais pas dans R1 et R3, ce qui pourrait être dû à la présence de NO. Cependant, au cours du processus d'enrichissement, il n'était pas clair si l'effet NO était dû à l'imposition d'un stress oxydatif ou parce qu'il était utilisé comme substrat pour l'oxydation de l'ammonium. Cela n'a pas pu être évalué car le nitrite était en excès lors de l'enrichissement. Par conséquent, pour déterminer si le NO est consommé, le nitrite a été systématiquement appauvri en R2 (Phase II) tout en dosant la même quantité de NO (Phase I). Après 76 jours d'appauvrissement en nitrite, le nitrite a été progressivement réintroduit en Phase III (Fig. 4).

L'effet de l'épuisement des nitrites (phase II) et de la réplétion (phase III) sur les changements dans (A) la communauté de bactéries anammox des OTU affiliées à Ca. B. caroliniensis () et Ca. B. sinica () et Ca. Jettenia () en suspension (mis en évidence par « granulés en suspension » sur l'axe des abscisses) et la biomasse de croissance attachée (mis en évidence par « biofilm sur le mur » sur l'axe des abscisses), et le taux de consommation de NO (NCR, ) de R2, alimenté avec des eaux usées synthétiques avec de l'ammonium, du nitrite et un apport continu d'oxyde nitrique. Le nitrite entrant (NO2) a été ajusté de la normale (Phase I), à l'épuisement (Phase II) et à la réplétion (Phase III). L'abondance relative des bactéries anammox totales est mise en évidence sous forme de graphique de zone (). Les images FISH ont été prises avec Ca. B. sinica en cyan et Ca. B. caroliniensis en magenta pendant la phase I (B) et la phase III (C) à partir de granulés broyés.

La réduction de la concentration de nitrite a entraîné une diminution de l'abondance relative de Ca. B. sinica en suspension coïncide avec une augmentation du taux de consommation de NO (NCR) alors qu'une légère augmentation a été observée pour Ca. B. caroliniensis et Ca. Jettenia en Phase II (Fig. 4). La présence de Ca. B. caroliniensis, absent en phase I, a également été détecté par analyse FISH en phase II (Fig. 4). Les tests d'activité par lots effectués au cours de la phase II ont également montré une baisse du taux d'élimination de l'ammonium dépendant du nitrite de 1352 mg N g MLVSS-1 jour-1 avant l'épuisement des nitrites (Phase I) à 681 mg N g MLVSS-1 jour-1 après l'épuisement des nitrites (Phase II). Néanmoins, l'activité globale dans R2 était toujours supérieure à celle de R1, même avec un taux d'élimination spécifique de l'ammonium dépendant du nitrite de 575 mg N g MLVSS −1 jour −1 (Fig. 5). En fonctionnement normal (phase I), l'oxydation de l'ammonium dépendante du NO en l'absence de nitrite dans les deux réacteurs était insignifiante, ce qui appuie davantage l'hypothèse selon laquelle le nitrite plutôt que le NO est l'accepteur d'électrons préféré et que l'élimination de l'ammonium ne peut pas être obtenue par Ca. B. sinica par couplage direct à la réduction de NO. En revanche, les taux d'oxydation de l'ammonium avec NO en l'absence de nitrite ont augmenté de plus de cinq fois dans R2 à 440 mg N g MLVSS-1 jour-1 après épuisement des nitrites en phase II par rapport à 33 et 80 mg N g MLVSS-1 jour-1 en R1 et R2, respectivement en phase I en fonctionnement normal (Fig. 5). Cela suggère la sélection d'espèces de bactéries anammox capables d'utiliser du NO fourni de l'extérieur pour oxyder l'ammonium.

Expériences d'activité discontinues avec (i) NH4 + NO2, (ii) NH4 + NO2 + NO, (iii) NH4 + NO dans le réacteur témoin R1 et le réacteur expérimental R2 (a) avant limitation des nitrites (phase I), (b) sous limitation des nitrites (phase II) et (c) après réplétion des nitrites (phase III).

Au début de la phase expérimentale III, Ca. B. caroliniensis s'est avéré être en abondance relative plus élevée que Ca. B. sinica dans les biofilms se formant sur la paroi du réacteur (Fig. 4). Californie. Jettenia a également montré une récupération, bien qu'à faible abondance (observée dans les échantillons de mur) en l'absence de nitrite (Fig. 4). Bien qu'il ne soit pas possible de confirmer si cela était une conséquence de l'épuisement des nitrites dans la phase II, les abondances relatives de Ca. B. caroliniensis et Ca. Les jettenias dans le biofilm prélevé sur le mur étaient plus élevées qu'en fonctionnement normal (Phase I sur la Fig. 6). Un net renversement de Ca. B. caroliniensis à Ca. B. sinica a été observé une fois le nitrite réintroduit entre 650 et 680 jours (Fig. 4). Semblable à celle détectée dans la phase II, l'augmentation de l'abondance relative de Ca. B. sinica a coïncidé avec la récupération de l'activité oxydante de l'ammonium dépendante du nitrite de 1163 mg N g MLVSS -1 jour -1, ce qui est comparable à celle de la phase I (1352 mg N g MLVSS -1 jour -1) (Fig. 4). De plus, l'activité d'oxydation de l'ammonium dépendante du NO a également diminué de 440 (Phase II) à 102 (Phase III) mg N g MLVSS-1 jour-1 (Fig. 5), ce qui suggère en outre que l'augmentation de la consommation de NO est probablement liée à l'augmentation de l'abondance de Ca. B. caroliniensis ou Ca. Jettenia ou les deux. Une période prolongée sous limitation des nitrites aurait pu encore améliorer la récupération de Ca. Jettenia et Ca. B. caroliniensis pour surpasser Ca. B. sinica. Néanmoins, cette partie de l'étude soutient un lien entre le nitrite et le NO, la sélection des espèces et leur mode de croissance préféré.

Répartition des OTU dominantes affiliées à Ca. B. sinica et Ca. B. caroliniensis, ainsi que d'autres bactéries anammox annotées Brocadiaceae et bactéries non anammox sur la paroi (couche externe) et en suspension (noyau interne) de (A) R1 au jour 289 (B), R2 au jour 265 (C) et R3 au jour 266 (D). La composition détaillée de la communauté microbienne peut être trouvée dans la Fig. S3 supplémentaire, Informations complémentaires.

Les bactéries anammox prédominantes ont également montré une nette préférence pour la croissance attachée dans les diverses conditions d'enrichissement. La biomasse de bactéries Anammox était présente principalement sous forme de granules en suspension dans R1 et R2, tandis que les biofilms attachés à la surface du réacteur dominaient dans R3 (Fig. S2 supplémentaire). Suite au transfert du biofilm de la paroi du réacteur en suspension (comme indiqué par la ligne pointillée sur la Fig. 1A à C), une augmentation plus importante du MLVSS de R3 (environ 1,5 g L−1 au jour 230) a été observée par rapport aux deux autres réacteurs (moins de 0,3 g L−1 aux jours 160, 209 et 258 dans R1 et 153, 216 et 253 dans R2), suggérant plus croissance du biofilm attaché dans le réacteur primaire alimenté en effluent (R3, Fig. 1C). De plus, suite à la réintroduction de nitrite dans R2 au cours de la phase expérimentale III, Ca. B. sinica a montré une tendance à la baisse, plus évidente dans les échantillons de biofilm prélevés sur les parois du réacteur (Fig. 4) qu'en suspension (p = 0,038). La différence d'abondance relative entre les échantillons de mur et de suspension indique une préférence de Ca. B. caroliniensis pour la croissance attachée. Il n'y avait pas de différence significative entre les populations de bactéries anammox des échantillons de biomasse prélevés sur le mur et la suspension dans R1 et R2, avec Ca. B. sinica comme bactérie anammox dominante. Cependant, l'abondance relative de Ca prédominant. B. caroliniensis était quatre fois plus élevée dans la biomasse prélevée sur le mur qu'en suspension pour R3 (Fig. 6), indiquant en outre que cette espèce a tendance à la croissance attachée (Fig. 6). Alors que des granules se sont formés dans R1 et R2 (Fig. 3A, B), avec une taille moyenne de particules de 1,52 et 1527,9 ± 0,078 μm (tableau supplémentaire S2) respectivement avec R = 0,35 (p = 0,006) entre les deux réacteurs, la morphologie des agrégats dans R3 ressemblait davantage à un floc (Fig. 3C), avec une taille de particules de 310,4 ± 0,2 μm (tableau complémentaire S2) avec R = 0,67 (p = 0,001) par rapport aux deux autres réacteurs. Par conséquent, il semble que le Ca. B. caroliniensis enrichi dans des conditions d'eaux usées domestiques contenant du carbone organique, ne peut pas supporter la maturation des granules et forme à la place des biofilms sur les murs, contrairement à Ca. B. sinica qui a été principalement détecté dans la biomasse granulaire.

Les différentes stratégies d'enrichissement ont également conduit à des communautés de bactéries non anammox discrètes dans les trois réacteurs, avec des abondances plus élevées d'OTU de bactéries non anammox dans R3 par rapport à R1 et R2 (Figs S1G, H & I). La supplémentation en source de carbone a augmenté la richesse (tableau supplémentaire S1) de la communauté microbienne dans R3 (Chao1 : 614 ± 42), mais enrichie de manière sélective pour la communauté bactérienne non anammox (Simpson 1-D : 0,04 ± 0,01) plutôt que pour les bactéries anammox (Simpson 1-D : 0,75 ± 0,17). Une richesse plus faible a été observée lorsque le nitrite et l'ammonium ont été utilisés comme substrats principaux dans R1 et R2 (Chao1 : 233 ± 31 et 249 ± 32 respectivement). La supplémentation en NO a conduit à une richesse légèrement plus élevée mais à une régularité plus faible dans R2 que dans R1. Californie. B. sinica était corrélé positivement avec les OTU affiliées à des Fimbriimonadia non classées (phylum Armatimonadetes) et à des Anaerolineaceae non classées (phylum Chloroflexi) dans R1 (rho de Spearman > 0,8, p < 0,001). Alors que l'abondance relative des bactéries non-anammox a été réduite en présence de NO, la même corrélation a néanmoins été observée dans R2. Cependant, dans R3, la communauté de bactéries non anammox a été remplacée par des OTU affiliées à des Comamonadaceae non classées (phylum Proteobacteria) et à des Bacteroidetes non classés et une corrélation négative a été observée entre les Bacteroidetes non classés et Ca. B. caroliniensis (rho de Spearman : − 0,7, p < 0,001). Notamment, les taxons affiliés à la famille des Comamonadaceae étaient presque absents dans R1 et R2, alors qu'ils restaient la communauté hétérotrophe dominante dans la biomasse à la fois attachée à la paroi du réacteur et en suspension dans R3, suggérant peut-être que ces taxons ont des interactions métaboliques avec Ca. B. caroliniensis et jouent un rôle dans la formation de biofilm (Fig. S3 supplémentaire).

La description des facteurs qui déterminent la différenciation de niche des bactéries anammox est nécessaire pour sélectionner des populations présentant les propriétés physiologiques et de croissance souhaitées. Cela peut améliorer le contrôle du processus et la stabilité opérationnelle. OTU de bactéries Anammox associées à Ca. Brocadia, Ca. Kuenenia, Ca. Anammoxoglobus et Ca. Jettenia OTU ont tous été détectés dans les systèmes de traitement des eaux usées3. Ici, les populations de bactéries anammox ont été sélectionnées à partir du même inoculum de boue activée. Ceci a été réalisé en fournissant différents substrats (c.-à-d. ammonium, nitrite, carbone organique et NO) à différentes concentrations et charges pertinentes pour les systèmes PN/A principaux et secondaires. L'enrichissement reproductible de deux espèces clés de bactéries anammox, Ca. B. caroliniensis et Ca. B. sinica, a été obtenue à partir d'une seule graine de boue activée provenant des tropiques et leurs niches écologiques préférées ont été décrites. Californie. B. caroliniensis prédominait dans tous les réacteurs à une charge en N < 500 mg NL-1 jour-1 et à des concentrations inférieures en N (concentration d'ammonium et de nitrite dans l'influent inférieure à 200 et 250, respectivement). Une augmentation de la charge et de la concentration de N a entraîné une succession vers Ca. B. sinica. Californie. B. caroliniensis était également l'espèce la plus compétitive en présence de carbone organique, comme le montre sa prévalence dans R3 dans des conditions de faible charge en N.

Il est possible que Ca. B. caroliniensis et Ca. B. sinica a développé sa propre niche en raison des différences de sensibilité à l'inhibition du nitrite puisque la concentration de nitrite a été augmentée pour augmenter la charge de N. Un changement de population de Ca. B. caroliniensis à Ca. B. sinica a été constamment observé avec une augmentation de la concentration de nitrite au-delà de 340 mg NO2–NL−1 dans l'alimentation (c'est-à-dire 170 mg NO2–NL−1 dans le réacteur). Bien que cela se situe dans la plage des concentrations inhibitrices rapportées pour les bactéries anammox de 40 à 400 mg NL-116, 17, 18, 30, 31, 32, un tel changement n'a pas encore été étudié au niveau de l'espèce.

Une autre explication de ce changement pourrait être que Ca. B. caroliniensis et Ca. B. sinica a des propriétés cinétiques intrinsèques différentes. En utilisant des cellules planctoniques enrichies, la constante d'affinité pour les nitrites et le taux de croissance spécifique de Ca. B. sinica a été déterminée à 0,47 mg NL−1 et 0,33 jour−1 (temps de doublement correspondant de 2,1 jours)29,33, ce qui est le taux de croissance maximal le plus élevé jamais signalé pour les bactéries anammox. Cela indique que Ca. Les B. sinica sont des stratèges r et se développeraient à des taux de charge en N élevés et à des concentrations d'ammonium et de nitrite33, comme observé dans notre étude. Cependant, une estimation similaire pour Ca. B. caroliniensis manque. L'analyse métagénomique a révélé que Ca. B. caroliniensis possède de multiples copies de transporteurs de nitrite/formiate (focA) qui offrent un avantage concurrentiel à de faibles concentrations de nitrite en raison d'une faible constante d'affinité intrinsèque pour le nitrite14. Cela pourrait potentiellement les aider à piéger le nitrite des dénitrificateurs hétérotrophes, en particulier lorsque la compétition pour le nitrite est plus élevée en présence de carbone organique.

Malgré le large éventail de conditions environnementales appliquées dans les trois réacteurs d'enrichissement, Ca. Brocadia est resté le phylotype le plus dominant tout au long du processus d'enrichissement, tandis que Ca. Kuenenia et Ca. Les anammoxoglobus que l'on trouve couramment dans les systèmes artificiels n'ont pas été détectés. Bien que l'abondance de toutes les bactéries anammox soit faible dans l'inoculum, les conditions opérationnelles, en particulier la charge relativement élevée en azote, ont contribué à l'enrichissement en Ca. Brocadia sur les autres34.

Le NO a été fourni dans R2 pour exercer un stress oxydatif et également pour sélectionner potentiellement les bactéries anammox utilisant le NO35. Bien que la présence de NO ne semble pas supprimer la croissance des bactéries anammox, elle peut avoir fourni un avantage concurrentiel à Ca. Jettenia dans R2, qui a augmenté jusqu'à une abondance relative maximale de 23 % avec Ca. B. caroliniensis à faible charge en N (Fig. 1). On sait peu de choses sur les moteurs écologiques et métaboliques de la niche de Ca. Jettenia, probablement parce qu'elles sont généralement moins abondantes que les autres genres de bactéries anammox3. Il a été démontré que de faibles concentrations de nitrite encouragent la prolifération de Ca. Jettenia sur Ca. B. sinica4, en accord avec cette étude. Cependant, Ca. Jettenia était beaucoup moins abondant que Ca. B. caroliniensis à de faibles taux de charge en nitrite. Néanmoins, deux espèces de bactéries anammox phylogénétiquement éloignées, Ca. B. caroliniensis et Ca. Il a été démontré que Jettenia coexistent dans le même système, ce qui corrobore les conclusions précédentes3. Cependant, étant donné que la surveillance de la communauté microbienne est basée uniquement sur le gène de l'ARNr 16S, un biais peut être induit en se concentrant sur une seule région du gène. Une validation supplémentaire à l'aide d'une approche de séquençage d'amorces multiples pourrait être entreprise pour améliorer la précision de la quantification 36.

La coévolution de Ca. B. caroliniensis et Ca. Jettenia pourrait également suggérer que Ca. B. caroliniensis pourrait utiliser NO. Une voie similaire de réduction des nitrites dans Ca. B. caroliniensis et Ca. Jettenia a été suggéré après la détection d'un homologue nirK à partir de l'analyse métagénomique de Ca. B. caroliniensis14,37. L'augmentation significative de l'oxydation de l'ammonium dépendante du NO suite à la limitation des nitrites était concomitante avec la récupération de Ca. B. caroliniensis et Ca. Populations de Jettenia. Une étude récente a rapporté la découverte de nirS dans un Ca. Brocadia genome38, cependant seuls des transcrits faibles ont été trouvés et cette observation nécessite une validation supplémentaire. Il est concevable que Ca. B. caroliniensis utilise un homologue nirK ou une nouvelle nitrite réductase utilisant la voie conventionnelle dépendante du NO pour la production d'hydrazine ou possède la capacité de passer à une voie dépendante du NO en l'absence de nitrite. Une voie alternative pour la production de NO par oxydation de l'hydroxylamine par une protéine de type hydroxylamine oxydoréductase (hao) a en effet été détectée par Park et al.14 et Irisa et al.39. Ils ont proposé que cette voie alternative puisse potentiellement être activée en cas de limitation des nitrites14. Il a également été démontré que le NO oxyde l'ammonium en diazote gazeux sous limitation des nitrites en Ca. B. fulgida21 et nirS canonique étaient absents de son génome40.

En revanche, l'oxydation de l'ammonium dépendante du NO était négligeable à des concentrations de NO significativement plus élevées, ce qui corrobore davantage l'affirmation selon laquelle le nitrite plutôt que le NO était l'accepteur d'électrons préféré et que l'élimination de l'ammonium ne peut pas être obtenue par Ca. B. sinica par couplage direct à la réduction de NO (Fig. 5). Alors que Ca. B. sinica n'a pas été complètement inhibée en l'absence de nitrite, son abondance relative a diminué sous la limitation des nitrites, comme indiqué précédemment. Cela confirme l'étude d'Oshiki et al.41 démontrant que Ca. B. sinica n'utilise pas de NO et d'ammonium pour la synthèse d'hydrazine, mais utilise à la place de l'hydroxylamine et de l'ammonium. Shaw et al.42 ont révélé à l'aide d'expériences de marquage au 15N que l'ammonium était oxydé en diazote via l'hydroxylamine comme intermédiaire au lieu de NO dans un Ca. Culture d'enrichissement de Brocadia, avec une électrode comme accepteur d'électrons. Il est à noter, cependant, qu'il n'est pas possible d'attribuer des comportements aux espèces avec une confiance absolue en l'absence de cultures pures. Toutes les bactéries anammox sont incultivables, et la seule possibilité d'attribuer des comportements aux espèces, d'identifier leurs niches et leurs conditions optimales de croissance, ce sont les études phénoménologiques sur les réacteurs d'enrichissement. Ici, des enrichissements compris entre 50 et 80 % ont été atteints, ce qui est élevé pour un réacteur à enrichissement de population43 ; ils se classent parmi les enrichissements en anammox les plus élevés qui aient été obtenus jusqu'à présent dans un SBR44. Un enrichissement à 99,5% peut être atteint par centrifugation à densité Percoll45, mais la biomasse élevée requise entrave la résolution de la communauté microbienne au niveau de l'espèce. Alors que les bioréacteurs à membrane ont été utilisés pour enrichir les populations planctoniques de Ca. B. sinica, Ca. Scalindua29 et Ca. K. stuttgartsiensis10, notre approche a également été enrichie pour les espèces qui préfèrent pousser dans des biofilms comme B. caroliniensis et Ca. Jettenia.

La rétention élevée des bactéries anammox dans les réacteurs est un facteur crucial pour un fonctionnement optimal en raison du faible taux de croissance de ces bactéries. Ceci peut être réalisé grâce à la fixation du biofilm sur les supports, à la formation d'agrégats de biomasse granulaire et à d'autres techniques de séparation telles que la filtration sur membrane pour empêcher le lessivage des bactéries anammox. Le choix de la rétention de la biomasse dans les systèmes anammox peut être guidé par le mode de croissance des espèces de bactéries anammox dominantes et la communauté microbienne coexistante dans des conditions opérationnelles spécifiques. Dans cette étude, il a été démontré que la communauté de bactéries anammox et leurs états d'agrégation pourraient être distincts dans des conditions principales et secondaires. Californie. B. caroliniensis, persistant probablement dans des conditions dominantes, a montré une préférence pour la croissance du biofilm attaché. Une diversité et une abondance élevées d'espèces hétérotrophes dans R3 ont également été observées en présence de carbone organique complexe. En particulier, Comamonadaceae est resté l'un des hétérotrophes les plus abondants dans le système à la fois en suspension et dans le biofilm. Les comamonadaceae se trouvent couramment dans les communautés formant des biofilms46,47 suggérant leur rôle potentiel dans l'aide à la formation de biofilms. Croissance attachée de Ca. B. caroliniensis a également été observé dans un procédé à grande échelle traitant le liquide d'un digesteur anaérobie alimenté en glycérol comme source de carbone externe14. Dans ce cas, les supports peuvent être utilisés pour fournir une grande surface afin d'obtenir une rétention élevée de la biomasse48. Les supports soutenant la croissance de biofilms attachés peuvent être appliqués dans diverses configurations, par exemple, dans des contacteurs biologiques rotatifs49, des réacteurs de biofilm à lit mobile50,51 et des réacteurs de biofilm séquentiels discontinus52. Cependant, Ca. B. sinica a dominé les biofilms d'anammox formant des granules (comme observé dans R1 et R2 exploités dans des conditions de flux latéral) et peut être séparé physiquement à l'aide d'un hydrocyclone comme avec les systèmes DEMON SBR53, des séparateurs à lamelles54 ou des configurations de boues activées à film fixe intégré (IFAS) avec un décanteur55. Une protéine extracellulaire particulière s'est avérée très abondante dans la matrice extracellulaire du Ca. Granules de B. sinica qui favorisent la formation de biofilm sur plusieurs échelles de longueur en raison de sa capacité à séparer les phases (gouttelettes et gels) et à favoriser l'adhérence56. Cela pourrait expliquer la plus grande tendance de Ca. B. sinica s'auto-agrège (c'est-à-dire en l'absence de substrat, contrairement à Ca. B caroliensis et Ca. Jettenia). Malgré l'absence de carbone organique apporté de l'extérieur, les hétérotrophes appartenant à la classe Fimbriimonadia (phylum Armatimonadetes) et à la famille Anaerolineaceae (phylum Chloroflexi) ont proliféré dans R1 et R2 avec une abondance relative de 10 à 15 %. Gao et al.57 ont suggéré un rôle important des Anaerolineaceae en tant que noyaux ou supports pour la formation de granules dans les boues d'anammox et leur augmentation de l'abondance au fil du temps suggérerait qu'elles pourraient avoir soutenu la granulation à la fois dans R1 et R2. Cependant, le rôle des bactéries hétérotrophes et leur interaction avec les bactéries anammox ne peuvent pas être entièrement découverts dans cette étude et nécessiteront une enquête plus approfondie.

Plusieurs espèces bactériennes anammox peuvent être enrichies à partir de la même boue activée. Californie. B. caroliniensis domine à de faibles charges de N, à la fois en présence et en l'absence de carbone organique et sous limitation de nitrite, et forme des biofilms attachés ; Californie. B. sinica le surpasse à des charges de N plus élevées et forme des granules; et la supplémentation en NO favorise le Ca Jettenia même s'il disparaît toujours à des concentrations élevées de nitrate. Ainsi, Ca. B. caroliensis domine probablement dans les processus anammox des eaux usées traditionnelles, où les porteurs seraient la meilleure stratégie de rétention du biofilm, Ca B. sinica dans les traitements secondaires avec des granulés la meilleure stratégie de rétention, et Ca Jettenia est peu susceptible d'être compétitif dans les systèmes de traitement des eaux usées. Collectivement, cette étude donne un aperçu de la compréhension de la relation entre la sélection des espèces, la morphologie de croissance et les conditions de traitement dans les applications principales et secondaires avec des implications importantes dans la conception, le contrôle et la gestion du processus anammox au niveau de l'espèce dans les systèmes de traitement des eaux usées à grande échelle.

Trois réacteurs discontinus de séquençage en plexiglas (SBR), chacun avec un volume de travail de 4 L (diamètre interne de 140 mm, hauteur de 260 mm) ont été utilisés ici et agités avec une turbine montée sur le dessus (rayon de 30 mm) à 200 tr/min. Ils ont été ensemencés avec des boues activées provenant d'une usine de récupération d'eau (WRP) à grande échelle effectuant l'élimination biologique des nutriments et traitant les eaux usées domestiques et industrielles à Singapour. R1 et R2 ont été alimentés avec un milieu synthétique dépourvu de carbone organique tandis que R3 a reçu l'effluent primaire collecté à partir du WRP une fois par semaine comprenant une source de carbone organique complexe. Le milieu synthétique a été préparé comme (g L−1) : KHCO3 1,25, KH2PO4 0,025, CaCl2·6H2O 0,3, MgSO4·7H2O 0,2 et FeSO4·7H2O 0,025 avec augmentation progressive de la concentration en ammonium (de 30 à 280 mg NL−1) et en nitrite (39–350 mg NL−1) et 1,25 mL L −1 de solution d'oligo-éléments comme décrit par van de Graaf et al.58. L'argon/CO2 (95/5 %) a été aspergé en continu à 25 ml min-1 tout au long de la phase anoxique pour empêcher la pénétration d'oxygène dans R1, tandis que R2 a été aspergé d'argon/CO2 et de NO avec un taux d'aspersion combiné de 25 ml min-1 jusqu'à une concentration finale en phase gazeuse de NO de 400 ppmv pour imposer un stress oxydatif. La concentration choisie de 400 ppmv était inférieure au seuil de tolérance précédemment rapporté de 600 ppmv pour les bactéries anammox22. R1 et R2 ont fonctionné en cycles de 12 h, chaque cycle comprenant 5 min d'alimentation, 108 min de cycle anoxique, 67 min de décantation et décantation. Les concentrations initiales d'ammonium et de nitrite ont été maintenues à 20 mg NL-1 dans le réacteur pendant les sept premières semaines, ce qui a donné un temps de rétention hydraulique (HRT) de 24 h (deux litres d'eaux usées synthétiques ont été introduits dans le réacteur à chaque cycle). Une fois l'élimination de l'ammonium de 100 % atteinte, les concentrations de NH4+ et de NO2− dans l'alimentation ont ensuite été augmentées par paliers de 20 mg NL−1. L'influent NO2− : NH4+ a été maintenu à un rapport molaire de 1,3 proche de la stoechiométrie théorique59. HRT a été progressivement diminué de 24 à 16 h pour R1 et de 24 à 12 h pour R2, conformément à la capacité d'élimination de N. Ainsi, R2 fonctionnait à un taux de chargement de N plus élevé que R1 en raison d'un temps de cycle plus court concomitant à des taux d'élimination de N plus élevés dans R2. Le pH n'était contrôlé ni dans R1 ni dans R2 et variait entre 7,2 et 7,8.

R3 a fonctionné en cycles de 8 à 12 h, chaque cycle comprenant 2 h d'alimentation, 5 à 9 h de phase anoxique (selon la durée du cycle appliqué) et 1 h de décantation et de décantation. Avant la décantation, le réacteur a été aspergé d'argon/CO2 pendant 5 minutes pour éliminer l'azote gazeux produit pendant la phase anoxique afin d'améliorer la capacité de décantation des boues. À chaque période d'alimentation, 2 L d'effluent primaire additionné de nitrite ont été ajoutés, ce qui a donné un HRT de 16 à 24 h. Le nitrite a été ajusté en fonction de la concentration en ammonium à un rapport molaire de 2:1 et stocké dans un refroidisseur à 4°C pour minimiser la dégradation. La composition en éléments nutritifs de l'effluent primaire a été mesurée après l'ajout de nitrite avec les valeurs moyennes indiquées dans le tableau supplémentaire S1. Une alimentation lente de 2 h a été appliquée pour minimiser l'introduction d'oxygène et le choc thermique de l'effluent primaire stocké dans le refroidisseur. Le pH du réacteur n'était pas contrôlé et variait entre 7,6 et 8,5 en raison de l'activité de dénitrification. À des fins d'enrichissement, le SRT n'a pas été contrôlé dans les trois réacteurs, la perte de boues ne se produisant que par échantillonnage pour les analyses de nutriments et de solides (SRT estimé à > 20 jours).

Une enveloppe chauffante a été connectée pour maintenir le SBR à 35 ± 0,05 °C pour R1 et R2 et 33 ± 1 °C pour R3. La concentration en oxygène dissous (OD) et le pH ont été surveillés en continu à l'aide du capteur d'OD Mettler Toledo InPro6050 et du capteur de pH Mettler Toledo-InPro 3250i, respectivement. Des échantillons ont été prélevés périodiquement à la fin du cycle et filtrés immédiatement avec des filtres de 0,2 µm pour les analyses de nutriments. Des échantillons de liqueur mixte ont été prélevés au milieu de la phase anoxique pour l'extraction de l'ADN. Pour déterminer la composition microbienne du biofilm à la surface du réacteur, des échantillons de biomasse de la paroi ont été prélevés à trois emplacements aléatoires après avoir vidé le réacteur au jour 289 pour R1, au jour 265 pour R2 et 266 pour R3. Les échantillons en suspension et de biofilm collectés ont été congelés instantanément dans de l'azote liquide et stockés à - 80 ° C jusqu'à l'extraction. Le biofilm à la surface du réacteur a été périodiquement nettoyé pour déterminer la concentration totale de solides en suspension dans la liqueur mixte (MLSS) et la fraction volatile (MLVSS) et la proportion de biomasse en suspension par rapport à la croissance attachée. Des échantillons de biomasse en suspension ont également été collectés pour l'analyse de la taille des particules et l'imagerie par microscopie optique après l'obtention d'un enrichissement stable.

Pour valider davantage l'effet du NO en tant que pression de sélection pour la sélection des espèces de bactéries anammox, R2 a été soumis à une déplétion et à une réplétion progressives en nitrites tout en maintenant la disponibilité de NO en tant qu'accepteur d'électrons sur trois phases expérimentales après l'obtention d'un fonctionnement stable : 3); Opération limitée de phase II-nitrite (jour 564–640) dans laquelle le nitrite a été réduit par étapes de 50 à 0 mg NO2–NL−1 tandis que l'ammonium et le NO ont été maintenus à 50 mg NH4–NL−1 et 400 ppmv, respectivement ; La phase III (jour 640–687) du nitrite a été progressivement réintroduite de 0 à 70 mg NO2–NL−1 avec les concentrations d'ammonium et de NO susmentionnées en phase II. Des échantillons de biomasse en suspension ont été collectés deux fois par semaine à partir de la liqueur mixte tout au long de l'expérience, mais le biofilm attaché au mur n'a été collecté qu'à partir de la phase III en raison de la quantité limitée de biomasse du mur. A chaque phase expérimentale, des tests d'activité par lots ont été réalisés en triple exemplaire avec 80 mg NH4+–NL−1, 100 mg NO2–NL−1 et/ou 400 ppmv NO en phase gazeuse dans les conditions suivantes avec (i) ammonium et nitrite uniquement, (ii) ammonium, nitrite et NO, et (iii) présence d'ammonium et NO uniquement. L'activité anammox de R1 en fonctionnement normal avec de l'ammonium et du nitrite fournis comme substrat a servi de témoin. Dans tous les tests d'activité par lots, des échantillons de liqueur mixte ont été prélevés toutes les 30 minutes et filtrés à travers des filtres Milipore de 0,22 µm pour l'analyse des nutriments.

Tous les échantillons prélevés pour l'analyse des éléments nutritifs ont été mesurés pour l'ammonium, le nitrite et le nitrate. L'ammonium a été mesuré à l'aide des kits Hach®, le nitrate et le nitrite ont été analysés à l'aide de la chromatographie ionique (Prominence, Shimadzu). MLSS et MLVSS ont été analysés selon les méthodes standard60. Le NO a été mesuré en phase gazeuse à l'aide d'un analyseur de chimiluminescence en ligne (modèle : 42i, Thermoscientific). L'analyse granulométrique a été effectuée à l'aide d'un analyseur de taille de particules à diffraction laser (modèle : SALD-MS30, Shimadzu), une analyse ANOSIM a été effectuée sur les mesures de taille de particules sur des échantillons prélevés dans différents réacteurs.

La biomasse en suspension a été collectée à partir de chaque réacteur et soumise à une analyse de taille. 1 mL de biomasse a été dispersé à la surface de la boîte de Pétri et les images ont été prises par le microscope à épifluorescence inversé AxioObserver Z1 (Leica, Allemagne) avec fonction brique/sceau. Les images ont ensuite été analysées avec l'image J61 Fonction d'analyse des particules.

L'ADN génomique a été extrait d'échantillons de biomasse à l'aide du kit FastDNA ™ SPIN pour le sol (MP Biomedicals, États-Unis) avec une optimisation selon Albertsen et al. (2015). Le séquençage de l'amplicon du gène de l'ARNr 16S apparié a été réalisé par DNAsense (http://dnasense.com/) à l'Université d'Aalborg (Danemark) avec le jeu d'amorces 515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′) et 806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) (Caporaso et al. 2011) par Illumina Miseq plate-forme comme décrit dans Law et al. (2016). Une analyse détaillée des données peut être trouvée dans les informations complémentaires (SI).

Pour confirmer davantage l'identification de la taxonomie au niveau de l'espèce, quatre bibliothèques de clones de gènes d'ARNr 16S ont été construites à partir d'échantillons collectés aux jours 74, 280 de R1 et 85, 270 de R2. Les séquences obtenues à partir de la bibliothèque de clones et du séquençage des amplicons d'ARNr 16S ont été utilisées pour générer un arbre phylogénétique par ARB. Les méthodes de bibliothèque de clones et de construction d'arbres phylogénétiques sont décrites en détail dans SI.

Des échantillons de biomasse en suspension ont été prélevés et fixés avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) pendant la nuit. Après lavage avec une solution saline tamponnée au phosphate 1 × (PBS, chlorure de sodium 130 mM, tampon phosphate de sodium 10 mM, pH 7, 2), les échantillons de biomasse ont été stockés avec 1: 1 éthanol à 100%: 1 × PBS à - 20 ° C. La FISH a été réalisée sur des échantillons de biomasse broyée selon la méthode décrite par Daims et al.62 avec les sondes répertoriées dans le tableau 1. Les lames ont été visualisées à l'aide d'un microscope confocal inversé Zeiss LSM 780 (Carl Zeiss, Jena, Allemagne).

Toutes les séquences brutes d'amplicon d'ARNr 16S utilisées dans ce manuscrit sont disponibles au NCBI sous Bioproject PRJNA604076. Contactez l'auteur correspondant Thomas Seviour ([email protected]) pour demander les données de cette étude.

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Cette recherche a été soutenue par la Fondation nationale de recherche de Singapour et le ministère de l'Éducation dans le cadre du programme de centre de recherche d'excellence, et par une subvention de programme de la Fondation nationale de recherche (NRF), numéro de projet 1301-IRIS-59. Nous tenons à remercier M. Larry Liew et le personnel du Public Utilities Board (PUB) de Singapour pour l'aide apportée à la collecte hebdomadaire des effluents primaires et M. Eganathan Kaliyamoorthy pour son aide dans l'analyse des solides.

Yang-Lu

Adresse actuelle : The Australian Centre for Ecogenomics, School of Chemistry and Molecular Biosciences, University of Queensland, St Lucia, QLD, 4072, Australia

Thi Quynh Ngoc Nguyen

Adresse actuelle : Agency for Science, Technology and Research, Singapour, 138632, Singapour

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Yang Lu et Gayathri Natarajan.

Centre de Singapour pour l'ingénierie des sciences de la vie environnementale, Université technologique de Nanyang, Singapour, 637551, Singapour

Yang Lu, Gayathri Natarajan, Thi Quynh Ngoc Nguyen, Sara Swa Thi, Krithika Arumugam, Thomas Seviour, Stefan Wuertz et Yingyu Law

Centre de technologie de l'eau (WATEC) et Département de génie biologique et chimique, Université d'Aarhus, Universitetsbyen 36, 8000, Aarhus C, Danemark

Thomas Séviour

Centre de Singapour pour l'ingénierie des sciences de la vie environnementale, Université nationale de Singapour, Singapour, 119077, Singapour

Rohan BH Williams

École de génie civil et environnemental, Université technologique de Nanyang, Singapour, 639798, Singapour

Stefan Würtz

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TS, YYL et YL ont écrit le manuscrit et conçu des expériences, RW, YL et KA ont analysé les données de séquençage, GN, TN et ST ont conservé et collecté des données expérimentales, YL et GN ont analysé les données expérimentales. Tous les auteurs ont contribué à la rédaction de l'article.

Correspondance à Thomas Seviour.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Lu, Y., Natarajan, G., Nguyen, TQN et al. Contrôle de la spéciation de l'anammox et de la stratégie de fixation du biofilm à l'aide d'intermédiaires de N-biotransformation et de niveaux de carbone organique. Sci Rep 12, 21720 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26069-2

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Reçu : 19 octobre 2022

Accepté : 08 décembre 2022

Publié: 15 décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-26069-2

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