Rapide, sensible et faible | Nanning Paon Pride Co., Ltd

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 7741 (2022) Citer cet article

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La mauvaise qualité de l'eau potable est l'une des principales causes de mortalité évitable, principalement chez les jeunes enfants. L'identification des sources d'eau contaminée reste un défi important, en particulier lorsque les ressources sont limitées. Les méthodes actuelles de mesure d'Escherichia coli (E. coli), l'indicateur préféré de l'OMS pour mesurer la contamination fécale de l'eau, impliquent une incubation d'une nuit et nécessitent une formation spécialisée. En 2016, l'UNICEF a publié un profil de produit cible (TPP) pour inciter les innovations de produits à détecter de faibles niveaux d'E. coli viables dans des échantillons d'eau sur le terrain en moins de 6 h. Poussés par ce défi, nous avons développé un test basé sur les phages pour détecter et semi-quantifier E. coli. Nous avons formulé un cocktail de phages contenant un total de 8 phages sélectionnés par rapport à une vaste bibliothèque de souches bactériennes et recombinés avec le rapporteur sensible NanoLuc luciférase. Le test a été optimisé pour être traité dans une puce microfluidique conçue en interne et a été testé sur des échantillons d'eaux usées d'origine locale et sur des sources d'eau potable à Nairobi, au Kenya. Avec ce test, combiné à la plate-forme de puce microfluidique, nous proposons une solution automatisée complète pour détecter et semi-quantifier E. coli à moins de 10 MPN/100 mL en 5,5 h par un personnel peu formé.

L'importance d'un accès durable à l'eau potable continue d'être essentielle pour réduire la pauvreté et améliorer la santé et le bien-être de la population mondiale. Bien que des progrès aient été réalisés vers les objectifs de développement durable et leur concentration sur l'amélioration de l'accès à l'eau potable (ODD 6)1, la qualité de nombreux approvisionnements en eau reste incertaine. Les maladies diarrhéiques, principalement dues à des aliments et à de l'eau contaminés, continuent d'être la deuxième cause de décès dans le monde chez les enfants de moins de cinq ans, causant 8 % de tous les décès dans le monde, 80 % des décès se produisant en Asie du Sud et en Afrique subsaharienne2. Inspecter la qualité de l'eau pour détecter la présence d'agents pathogènes causant la diarrhée est vital pour le bien-être de millions de personnes.

L'un des risques microbiens les plus importants est associé à l'ingestion d'eau contaminée par des matières fécales humaines ou animales3. Bien que la plupart des coliformes soient inoffensifs pour l'homme, ils sont utilisés dans les tests pour indiquer la présence potentielle d'agents pathogènes dangereux. E. coli, en particulier, possède de nombreuses caractéristiques idéales d'un organisme indicateur car il est dérivé presque exclusivement de matières fécales humaines et animales et comprend quelques souches pathogènes (par exemple, O157:H7)4. Alors que l'utilisation d'indicateurs fécaux (coliformes, coliformes thermotolérants, E. coli) a été critiquée puisque leur présence implique seulement que le risque de présence d'agents pathogènes a augmenté, la surveillance des centaines d'agents pathogènes connus d'origine hydrique reste peu pratique et extrêmement difficile à faire rapidement et à faible coût4. De plus, l'information sur la quantité de l'indicateur fécal est essentielle car le risque de contracter une infection d'origine hydrique augmente avec le niveau de contamination.

Des limites bactériennes acceptables ont été définies par l'OMS3, entre autres, et stipulent que toute eau destinée à la consommation ne doit pas contenir d'E. coli détectable ou de bactéries coliformes thermotolérantes dans un échantillon de 100 ml, E. coli étant désormais l'indicateur préféré. Les méthodes les plus utilisées pour détecter les coliformes dans les échantillons d'eau sont la filtration sur membrane, la fermentation en tubes multiples utilisant la méthode du nombre le plus probable (MPN) et les tests de présence/absence tels que le test de sulfure d'hydrogène5. Bien que ces méthodes puissent atteindre une sensibilité de 1 UFC/100 mL entre 0,5 et 7,5 $/test, elles sont souvent laborieuses, nécessitent une formation spécialisée du personnel, sont difficiles à utiliser sur le terrain et nécessitent de longs temps d'incubation, généralement la nuit6. Aucun test ne peut détecter rapidement de faibles niveaux d'E. coli viables dans l'eau en moins de 8 h7.

L'équipe d'innovation de produits de l'UNICEF a lancé le projet de détection rapide d'E. coli pour promouvoir le développement de nouveaux produits afin de donner aux communautés et aux partenaires gouvernementaux les informations essentielles sur la qualité de l'eau, leur permettant de traiter l'eau insalubre et d'identifier les domaines d'amélioration de la contamination de l'eau. En conséquence, l'UNICEF a publié un profil de produit cible (TPP) pour guider les industries dans le développement de produits qui déterminent avec précision la contamination fécale le plus rapidement possible8.

Une nouvelle génération de tests utilise des bactériophages modifiés pour détecter les agents pathogènes9, 10. Les phages sont des virus qui infectent et se multiplient dans les bactéries et font partie des entités les plus courantes et les plus diverses de la biosphère. Ils présentent des gammes d'hôtes spécifiques en raison d'interactions complexes entre les protéines de fixation des phages et la surface des cellules bactériennes11. Les phages peuvent être génétiquement modifiés pour transporter l'information génétique d'une protéine rapporteur qui est exprimée à l'intérieur de la bactérie lors de la réplication du phage. L'utilisation de phages rapporteurs comme méthodes de détection a déjà été démontrée pour détecter des agents pathogènes, notamment Listeria12, Mycobacterium13, Salmonella14 et E. coli15. Les rapporteurs couramment utilisés comprennent, entre autres, la phosphatase alcaline16, la protéine fluorescente verte (GFP)13, la luciférase bactérienne (systèmes lux)12, 17 et la luciférase NanoLuc®18,19,20. La luciférase NanoLuc produit un signal de luminescence 100 fois plus fort que les autres luciférases et est une protéine plus petite (19 kDa) qui s'appuie sur le substrat furimazine pour produire une luminescence stable de type lueur21.

Ici, nous utilisons un cocktail de phages rapporteurs NanoLuc luciférase pour détecter spécifiquement la contamination par E. coli dans l'eau. Nous avons développé un test très sensible et rapide qui permet la détection de moins de 10 MPN E. coli dans 100 ml d'eau en 5,5 h, ce qui répond aux exigences de l'UNICEF TPP et permet ainsi des tests le jour même. Le cocktail de phages a une large gamme d'hôtes E. coli qui permet d'utiliser le test sur n'importe quelle source d'eau. Enfin, le test est effectué dans une puce microfluidique conçue pour s'intégrer à un prototype d'instrument automatisé (une unité de filtration, une unité de manipulation de liquide et une unité de détection)22 pour une utilisation sur le terrain. Le coût global du dispositif microfluidique jetable est inférieur à 1 $ et l'instrumentation associée répond aux objectifs de coût fixés par le TPP8 de l'UNICEF, faisant de cette plate-forme une alternative appropriée aux kits de test de terrain E. coli actuels.

Dans le bactériophage T4, Hoc (protéine de capside externe hautement antigénique) est une protéine de décoration de capside non essentielle hautement exprimée23, dont le locus génique a été utilisé avec succès pour insérer des protéines dans le génome du phage24. Des protéines similaires ont été identifiées dans de nombreux bactériophages et virus double brin25,26,27,28. L'analyse de la séquence génomique de notre bibliothèque de phages a indiqué la présence d'homologues Hoc dans plusieurs génomes, notamment BW-1, HER252, Phi3, RB69, T7, TH07 et TH09, et a été utilisée comme site d'insertion pour un rapporteur NanoLuc fusionné à une cassette d'expression à motif de liaison à la cellulose (CBM). Comme illustré à la Fig. 1a, nous avons utilisé le système CRISPR/Cas929,30,31 pour concevoir tous les phages, à l'exception de T7 et TH09, pour lesquels la recombinaison homologue plus simple était suffisante à elle seule pour introduire de l'ADN recombinant dans le génome du phage.

( a ) Schéma de la recombinaison de phages in vivo à l'aide du système CRISPR-Cas9. Les cellules bactériennes hôtes sont transformées avec un plasmide donneur contenant le rapporteur NanoLuc-CBM flanqué de régions d'homologie gauche et droite avec le phage (LHR et RHR) ainsi que des séquences d'ARNr et d'espaceur sélectionnées. (b) Le test de plaque de phage montre la présence de plaques dans la pelouse bactérienne (photo du haut) et l'activité NanoLuc dans les plaques lorsqu'elles sont imagées dans une pièce sombre (photo du bas). Créé avec BioRender.com.

Le plasmide pCas9 exprime S. pyogenes Cas9 et tracrRNA à partir de son promoteur natif, et une séquence synthétique en aval du promoteur Lac exprime de manière constitutive la séquence de tête crRNA et trois espaceurs flanqués de répétitions directes. L'utilisation d'espaceurs multiples dirigés vers le locus hoc d'un phage spécifique est double ; (1) plusieurs ARNg dirigés vers un locus maximisent la fréquence du clivage médié par Cas9 du phage ciblé (2) la conservation de la séquence dans le locus hoc permet l'utilisation d'une séquence synthétique pour concevoir plusieurs phages (avec un ou deux espaceurs conservés).

La performance des ARNg a été déterminée en mesurant l'efficacité de la plaque (EOP), définie comme la réduction logarithmique du titre de phage sur la souche exprimant à la fois Cas9 et ARNg par rapport à la souche exprimant uniquement Cas9. Une efficacité de plaque de 3 ou plus a indiqué que le système CRISPR/Cas9 fonctionne comme souhaité, et les ARNg ont été sélectionnés pour générer des phages recombinants (tableau S2). La recombinaison homologue réussie a été confirmée par l'activité NanoLuc dans les plaques formées par les phages recombinants et le séquençage (Fig. 1b). De manière surprenante, l'un des phages exprimant NanoLuc isolés lors de la construction du phage recombinant TH09 a montré une homologie limitée avec la séquence du phage TH09 parent. Nous émettons l'hypothèse que son phage parent d'origine était présent à une très faible concentration, a subi une recombinaison dans la région homologue au plasmide donneur TH09 et a été sélectionné sur la base de l'activité NanoLuc. La comparaison de séquence a indiqué qu'il s'agit d'un phage de type T4. Ce phage a été nommé PJ133.

En raison de la nature du promoteur entraînant l'expression du rapporteur, NanoLuc est exprimé de manière constitutive lors de l'amplification des phages pour produire des réactifs à titre élevé et contribue au signal de fond dans les tests ultérieurs. Par conséquent, pour améliorer la sensibilité de nos tests en aval, nous avons développé des méthodes pour purifier le journaliste.

Le phage T7 a été purifié en tirant parti du module de liaison à la cellulose (CBM) fusionné à NanoLuc et en utilisant des lavages consécutifs avec des billes à base de cellulose pour lier et éliminer le rapporteur. Cette méthode, initialement destinée à être utilisée pour tous les phages recombinants, n'a pas été efficace pour les autres phages. Nous avons émis l'hypothèse que certains des phages se lient aux billes, ce qui entraîne un faible titre final de la solution de phage purifiée et que, dans certains cas, le rapporteur se lie aux billes avec une faible efficacité, ce qui entraîne un signal de fond élevé, comme cela a été observé pour le phage Phi6. La filtration à flux tangentiel (TFF) utilisant des cartouches avec des membranes de coupure de 500 kDa s'est avérée être une méthode fiable pour éliminer le rapporteur de ces solutions de phages. La filtration a été effectuée pendant 12 à 18 h jusqu'à ce que les valeurs de luminescence plafonnent à ou en dessous de 1000 RLU. L'efficacité de la filtration a été constamment améliorée par l'ajout de détergent (0,05 % de tween 80) au milieu pendant la croissance des cellules bactériennes et la propagation des phages32. Des concentrations allant jusqu'à 0, 3% de Tween 80 n'ont pas affecté la croissance bactérienne et l'infection par les phages (Fig. S1).

Un processus de sélection descendante de phages suivant plusieurs étapes décrites dans le schéma de la figure 2a a été utilisé pour déterminer la composition finale du cocktail de phages.

(a) Description du processus de sélection des phages : 1. Le test de plaque est effectué avec la totalité de la bibliothèque de phages (92 souches) contre un sous-ensemble de la bibliothèque d'E. coli (79 souches). Le fichier supplémentaire 2 contient les données détaillées sur la plaque de plaque, 2. Les phages sont sélectionnés (20 souches) en fonction de la gamme d'hôtes additive calculée, 3. Les phages sont encore sélectionnés (10 souches) en fonction de l'efficacité de la recombinaison avec le rapporteur NanoLuc, 4. Performances du test de luminescence contre l'ensemble de la bibliothèque E. coli (339 souches), le succès de la purification et la stabilité générale pour déterminer la composition finale du cocktail de phages (8 souches). (b) % de bactéries produisant des plaques lors d'une infection par un phage. (c) % de souches d'E. coli sensibles aux phages recombinants déterminées par dosage de luminescence. La gamme d'hôtes est généralement plus large sur le test de luminescence par rapport aux résultats du test de plaque sur des souches appariées (l'encart montre des exemples ; la figure S2 contient la liste complète des phages et le fichier supplémentaire 2 montre une comparaison directe sur des souches correspondantes).

Pour la première étape, les gammes d'hôtes de 92 phages de notre bibliothèque ont été testées par essai sur plaque sur un sous-ensemble de souches d'E. coli constituées de la première moitié de la bibliothèque ECOR (souches #1 à #36)33 et 43 souches environnementales. Dans cette expérience, la formation de plaques observées dans le tapis de la souche hôte a démontré la réplication et la propagation du phage au sein de l'hôte et, par conséquent, la sensibilité de la souche bactérienne testée. Les phages présentent une grande variabilité dans la sensibilité de l'hôte, certains présentant des gammes d'hôtes étendues. Par exemple, plus de 25 % des souches hôtes ont démontré une sensibilité aux phages TH09 et HER259, tandis que 14 phages n'ont formé de plaque sur aucune des 79 souches bactériennes testées (Fig. 2b et Tableaux S4 et S5 et Fichier supplémentaire 2). Sur la base de l'étendue des couvertures d'hôtes individuels de phages et de la couverture additive calculée des phages utilisés en combinaison, 20 phages ont été sélectionnés pour être génétiquement modifiés.

Le rapporteur enzymatique NanoLuc a été introduit avec succès dans les génomes de douze phages, et leurs gammes d'hôtes ont été évaluées à l'aide du test de luminescence sur l'ensemble de la bibliothèque interne de souches d'E. coli (339 souches décrites dans les méthodes et répertoriées dans les tableaux S2 et S3). Pour le test de luminescence, qui est plus propice au criblage à haut débit, un signal provenant de puits contenant à la fois un hôte E. coli et un phage recombinant a été comparé à des puits témoins contenant uniquement le phage recombinant (Fig. 2c). La sensibilité positive de l'hôte a été enregistrée dans tous les puits avec une luminescence supérieure aux valeurs de fond moyennes + 3 écarts-types (SD). En comparant les résultats obtenus pour les tests de plaque et de luminescence sur des souches correspondantes, nous avons remarqué que la gamme d'hôtes basée sur le test de luminescence est généralement plus large et montre une sensibilité supplémentaire à la gamme d'hôtes (fichier supplémentaire 2). Par exemple, cette observation est évidente pour les phages HER252, BW-1 et PJ133, pour lesquels la gamme d'hôtes a augmenté de 49 %, 57 % et 75 %, respectivement (Fig. 2c, encadré et Fig. S2 montre le reste des phages). Une comparaison de la gamme d'hôtes mesurée par essai sur plaque entre les phages modifiés et de type sauvage a été testée pour le phage T2 et n'a pas montré de différences de gamme d'hôtes suggérant que le changement de gamme d'hôtes n'est pas dû à la manipulation du génome du phage. De plus, la gamme d'hôtes du phage PJ133 modifié est plus large lorsqu'elle est évaluée par luminescence que par dosage de plaque (fichier supplémentaire 2).

La liste des phages sélectionnés a été affinée en fonction de plusieurs facteurs tels que le temps de lyse, l'efficacité de la production de rapporteurs et la stabilité de la solution de phage purifiée, dans le but de combiner des phages avec des titres élevés (> 109 PFU/mL) et un faible fond de luminescence qui induisent l'expression d'un signal de luminescence élevée relativement rapide (< 3 h) et qui sont stables à 4 °C. Par exemple, les phages rapporteurs Phi7 et T7 ont des gammes d'hôtes similaires basées sur la luminescence ; cependant, T7 a produit un signal de luminescence positif deux heures plus tôt et a été sélectionné par rapport au phage Phi7. Le titre du phage T2 a diminué de quelques logs au cours de quelques semaines pendant le stockage à 4 ° C et n'a pas été poursuivi en tant que candidat pour le cocktail. De même, le titre du phage T6 s'est avéré diminuer pendant les étapes de centrifugation et a également été dépriorisé en faveur d'autres phages avec une meilleure stabilité pendant la purification. Enfin, le phage Phi6 a été éliminé au début du processus en raison d'une faible efficacité de purification entraînant des niveaux de fond de luminescence élevés.

À la fin du processus d'ingénierie et de sélection des phages, un cocktail de phages a été développé, contenant huit phages : BW-1, HER252, Phi3, PJ133, RB69, T7, TH07 et TH09. Le résultat du test de gamme d'hôtes basé sur le test de luminescence sur l'ensemble de notre bibliothèque de souches d'E. coli pour les phages sélectionnés est illustré à la Fig. 2c. La couverture de la gamme d'hôtes varie de 27 % (T7) à 70 % (BW-1) et ajoute jusqu'à 90 % de la bibliothèque si nous supposons qu'il n'y a pas d'interférences négatives des différents phages.

La souche de laboratoire ATCC 25922 a été choisie pour déterminer la durée de l'infection par les phages afin d'atteindre la limite de détection bactérienne la plus basse, en utilisant le cocktail de huit phages car il s'agit d'une souche QC répertoriée par l'US EPA pour l'analyse de l'eau potable. La souche est sensible aux phages HER252, BW1 et PJ133, le phage BW1 induisant le signal de luminescence le plus fort (Fig. S3). Lorsque les phages sont en cocktail, nous avons observé que le signal était dominé par le phage induisant le signal le plus fort. Une dilution en série de cellules bactériennes en phase stationnaire a d'abord été incubée dans une plaque à 96 puits dans un milieu de croissance pendant 2 h à 37 ° C pour permettre la récupération et préparer les cellules pour l'expression des protéines avant l'ajout du cocktail de phages.

Pour l'étape d'infection par les phages, les bactéries ont été incubées avec les phages pendant 1, 1,5, 2 ou 2,5 h avant de concentrer le rapporteur NanoLuc exprimé et de mesurer le signal de luminescence résultant. Le signal est normalisé à la luminescence de fond générée par le cocktail de phages uniquement et comparé pour les différents temps d'infection à plusieurs concentrations cellulaires afin de déterminer la limite de détection correspondante pour chaque condition (Fig. 3). La valeur MPN (nombre le plus probable) représente le nombre de cellules qui ont été ajoutées par puits tel que déterminé par un système Quanti-Tray/2000, en triple exemplaire. À mesure que le temps de contact entre les cellules phages et bactériennes augmente, la limite de détection du signal au-dessus du fond diminue. Par exemple, une période d'incubation de 1, 1,5 et 2 h se traduit par un signal deux fois sur fond de 60, 20 et 8 cellules, respectivement. Le temps d'incubation supplémentaire après 4 h d'incubation totale n'entraîne pas d'augmentation du signal sur la plage de nombres de cellules testées.

Signal de luminescence médian de 8 répliques avec plage interquartile normalisée au fond du phage uniquement en fonction du MPN/puits pour des incubations de phage de 1, 1,5, 2 et 2,5 h en utilisant ATCC 25922 et le cocktail de 8 phages. Les valeurs NPP ont été déterminées par Quanti-Tray/2000, en triple exemplaire. La ligne pointillée représente les valeurs à 2 × fond.

A noter qu'avec la souche ATCC 25922, il ne semble pas y avoir d'avantage ni d'inconvénient à incuber les bactéries avec les phages pendant plus de 2h car on observe un plafonnement du signal après 2h. Ainsi, pour les expériences ultérieures avec des échantillons de terrain contenant des populations bactériennes non caractérisées et dans le dispositif microfluidique22, nous utiliserons un temps d'incubation de phage de 3 h pour nous assurer que toutes les bactéries ont le temps de produire le rapporteur enzymatique.

Nous avons assemblé une banque d'E. coli avec une large diversité géographique (tableaux S2 et S3) et génétique pour sélectionner les phages du cocktail33. Pourtant, nous voulions évaluer au début de la formation du cocktail si ce processus de sélection des phages était biaisé en faveur des populations bactériennes spécifiques à notre collection. Ainsi, au moment de cette évaluation sur le terrain, notre cocktail était à un stade précoce de développement et contenait quatre phages, à savoir Phi3, Phi7, RB69 et T7. Les performances du cocktail de phages préliminaire ont été testées en combinaison avec un premier prototype de puce microfluidique conçu pour remplacer les étapes manuelles du test, comme décrit dans nos travaux précédents22 (Fig. 4a). La puce intègre une première membrane où les bactéries sont capturées, infectées par le phage, et le rapporteur est exprimé. Une seconde membrane dans le dispositif est l'endroit où le rapporteur exprimé est concentré et détecté. La performance du test microfluidique basé sur les phages a été testée sur des échantillons de terrain locaux prélevés dans la rivière Ngong qui traverse la ville de Nairobi, au Kenya. Les échantillons étaient, en général, très troubles et fortement contaminés. Des dilutions des échantillons ont été préparées dans de l'eau distillée stérile avant le traitement pour évaluer une gamme de concentrations bactériennes (Fig. 4b).

Validation du dosage préliminaire du cocktail de phages sur des échantillons d'eaux usées locales. (a) Premier prototype du dispositif microfluidique pour la détection d'E. coli dans des échantillons d'eau. Barre d'échelle : 10 mm (b) Signal de luminescence normalisé sur le fond de phage uniquement d'échantillons d'eau obtenus à l'aide d'un cocktail de 4 phages (Phi3, Phi7, RB69 et T7) et traités par le dispositif à puce microfluidique. Des échantillons d'eau ont été prélevés dans la rivière Ngong qui traverse la ville de Nairobi. Les valeurs d'UFC ont été déterminées à l'aide d'un kit de terrain de filtration sur membrane. La ligne pointillée représente les valeurs à 2 × fond.

Des ajouts de fluide à la puce microfluidique ont été effectués manuellement à l'aide d'accessoires jetables en caoutchouc de silicone entourant les orifices d'entrée/sortie fournissant une interface pour les pointes de pipette contenant les réactifs nécessaires et les tubes connectés à la source de vide. Une source de vide connectée aux orifices de sortie a été utilisée pour contrôler le flux fluidique dans le dispositif microfluidique. Dans cette expérience, le volume d'eau traité était de 10 ml, ce que nous avons montré dans une étude précédente pour donner des résultats équivalents au même nombre de bactéries dans un volume d'échantillon de 100 ml22. Le test a été exécuté pendant un total de 5 h, divisé en une période de récupération des bactéries de 2 h suivie d'une infection par le phage de 3 h pour garantir suffisamment de temps aux cellules pour produire l'enzyme rapporteur NanoLuc.

D'après nos résultats, nous observons un signal clair sur fond pour les deux échantillons testés contenant 9 UFC et pour un échantillon sur deux contenant 8 UFC (Fig. 4). Ces résultats démontrent qu'avec un cocktail de 4 phages, on peut déjà mesurer moins de 10 UFC d'E. coli par 100 mL d'eau. Notez également que le kit de test de filtration utilisé comme méthode de référence ici détecte la présence de coliformes thermotolérants et non spécifiquement E. coli, représentant seulement environ 80 % des coliformes thermotolérants34, 35. De plus, il y a environ 15 à 20 fois plus de non-E. coli dans les échantillons, tel que déterminé par le comptage total sur plaque effectué par le laboratoire AgriQ Quest à Nairobi, où nous avons traité les échantillons, et l'abondance relative du genre Escherichia/Shigella dans la population bactérienne des boues fécales est estimée à 0,1-0,8 %36. Cela indique que le test ne détecte pas les bactéries non E. coli et que la gamme d'hôtes des phages est spécifique à E. coli. Des résultats similaires ont été observés pour les expériences menées sur les échantillons de rivière dans un format de plaque à 96 puits, ce qui nous a permis de tester un plus grand nombre d'échantillons et de répétitions (Fig. S4). Sur la base de ces résultats préliminaires, qui ont confirmé que notre bibliothèque d'E. coli était suffisamment diversifiée, nous avons poursuivi le développement du cocktail de phages pour concevoir un test potentiellement plus robuste avec une gamme d'hôtes accrue et une limite de détection inférieure. Notez qu'au moment des tests, le phage Phi7 faisait partie du cocktail mais s'est avéré plus tard ne pas augmenter les performances du cocktail global et a été supprimé au profit de phages plus performants.

Le cocktail de phages complet, contenant 8 phages, a été testé avec des échantillons d'eaux usées prélevés dans une usine locale de traitement des eaux (King County South Water Treatment plant à Renton, WA USA). En ce qui concerne notre évaluation sur le terrain du cocktail partiel, le test a été effectué à l'aide d'une puce microfluidique conçue en interne, cette fois avec une version mise à jour illustrée à la Fig. 5a et décrite plus en détail dans des travaux antérieurs22. La nouvelle version du dispositif microfluidique contient toutes les mêmes unités fonctionnelles de la version précédente ; cependant, de petites modifications ont été apportées pour permettre un processus de fabrication moulé par injection, ce qui a considérablement réduit le coût global du test. Plusieurs dilutions de l'échantillon d'eaux usées ont été préparées en double (valeurs NPP> 1000) ou en triple (valeurs NPP <1000) pour générer une gamme de concentrations cellulaires à tester (Fig. 5b).

Validation du dosage final du cocktail de phages sur des échantillons d'eaux usées locales. (a) Deuxième prototype du dispositif microfluidique pour la détection d'E. coli dans des échantillons d'eau. Barre d'échelle : 10 mm (b) Signal de luminescence normalisé sur le fond de phage uniquement des échantillons d'eaux usées obtenus à l'aide du cocktail de 8 phages et traités par le dispositif à puce microfluidique. Les valeurs NPP ont été déterminées avec un test Quanti-Tray/2000. La ligne pointillée montre une régression linéaire effectuée sur un sous-ensemble de données, entre les valeurs MPN de 1 et 100. La ligne pointillée représente les valeurs à 2 × fond.

Les données présentées ici agrègent les résultats obtenus avec des échantillons d'eaux usées prélevés sur deux jours différents et pour lesquels aucune différence n'a été observée. La valeur x < 1 correspond à un test Quanti-Tray/2000 négatif qui a une valeur de nombre le plus probable (MPN) assignée inférieure à 1/100 mL selon les instructions du fabricant. Pour ces échantillons, le signal de luminescence mesuré est comparable au signal de fond des contrôles de phage uniquement. À une valeur MPN de 1 (intervalle de confiance (IC) à 95 % = 0–3,7 indiqué par le fabricant), le test de phage détecte un signal plus de 2 fois sur le bruit de fond dans seulement 1 échantillon sur 3. À de très faibles concentrations cellulaires, la population bactérienne suit une distribution de Poisson37, ce qui explique que certains des échantillons dilués peuvent contenir des cellules tandis que d'autres non. Cependant, à une valeur MPN de 6, avec un IC à 95 % = 2,3–12,1 indiquant que la plupart des échantillons contiennent des bactéries, un signal environ 5 fois supérieur au bruit de fond est détecté dans les trois répétitions. Nous avons effectué une régression linéaire dans la plage inférieure du nombre de cellules uniquement (< 100) pour démontrer une courbe d'étalonnage simple pour notre test. Cela nous permet de déterminer les plages de nombre de bactéries en fonction de la réponse de luminescence mesurée avec le test : < 1, entre 1 et 10, entre 10 et 100 et > 100.

Des méthodes rapides, peu coûteuses et utilisables sur le terrain pour indiquer la présence d'agents pathogènes dans les sources d'eau dans les milieux à faibles ressources sont nécessaires pour identifier les sources contaminées. Les méthodes actuellement disponibles pour les organisations gouvernementales et à but non lucratif qui effectuent souvent des tests pour quantifier la contamination par E. coli impliquent généralement de longues périodes d'incubation et des processus compliqués. De plus, ils nécessitent une formation spécialisée ou les échantillons doivent être transportés et traités dans un laboratoire. Malheureusement, cela n'est souvent pas possible en raison du manque d'infrastructures nécessaires à proximité.

La conception d'un test rapide et peu coûteux pour détecter de faibles niveaux de bactéries E. coli viables dans un grand volume d'eau (100 ml) s'est avérée difficile pour la communauté scientifique. Les efforts antérieurs ont eu du succès dans le développement de phages rapporteurs pour cette application18, 38, 39. Malheureusement, les méthodes utilisent des souches et des phages de laboratoire avec des gammes d'hôtes et des protocoles d'analyse très limités, ce qui les rend inadaptés aux applications sur le terrain. Pour combler cette lacune, nous avons criblé une bibliothèque de 92 phages, dont plus de 50 nouveaux phages isolés pour ce travail, et validé les performances d'un dispositif microfluidique que nous avons précédemment développé dans notre laboratoire sur des échantillons d'eau environnementale du monde réel provenant de divers endroits. Notre méthode globale combine :

Un cocktail de phages avec une large gamme d'hôtes spécifiques à E. coli.

Un rapporteur enzymatique, la NanoLuciférase, qui, combiné au substrat NanoGlo, produit un signal luminescent très brillant permettant une faible limite de détection.

L'invention concerne un dispositif microfluidique jetable combinant une étape de concentration de bactéries, une infection de phage in situ et une concentration de rapporteur exprimé pour augmenter la sensibilité du dosage avant la détection.

Comme première étape vers le développement du test, nous avons identifié et conçu plusieurs phages qui ont été sélectionnés en fonction de diverses caractéristiques (possibilité d'être recombinés avec le rapporteur NanoLuc, stabilité pendant et après les processus de purification, pureté et titre finaux du phage, temps pour générer un signal et intensité du signal de luminescence résultant de l'infection) à combiner dans un cocktail de phages. L'assemblage d'une bibliothèque de souches d'E. coli pour sélectionner les phages était basé sur la diversité génétique et géographique avec un biais pour les souches isolées dans des environnements à ressources limitées. Le processus de sélection des phages était basé sur des données empiriques car nous n'avons pas trouvé de moyens de prédire la stabilité des phages ou le succès des processus de purification. Lors de la détermination de la gamme d'hôtes, nous avons observé que, pour tous les phages testés, la gamme d'hôtes déterminée par dosage de luminescence est plus large que lorsqu'elle est déterminée par dosage de plaque. Nous émettons l'hypothèse que cette différence est le résultat d'infections abortives40, dans lesquelles une cellule bactérienne infectée meurt prématurément et empêche ainsi la production et la propagation ultérieure de phages matures. Bien qu'une infection soutenue ne soit pas générée et que des plaques ne soient pas observées, l'enzyme rapporteur est produite à des niveaux suffisamment élevés pour être détectés. Alternativement, des modifications du test de plaque (par exemple, une concentration plus faible de superposition de gélose molle) pourraient avoir un impact sur la morphologie de la plaque et seront explorées plus avant pour déterminer si un accord peut être atteint entre les résultats du test de plaque et de luminescence.

L'expression de l'enzyme rapporteur est contrôlée par un promoteur constitutif et est donc produite lors de la propagation du phage. Par conséquent, nous avons consacré d'importants efforts de développement dans les méthodes de purification pour produire des réactifs de phage avec des titres élevés et une faible concentration de reporter qui ne génèrent pas de signal de fond substantiel. Seul le phage T7 a pu être efficacement purifié en utilisant des cycles successifs de purification sur billes de cellulose. Avec cette méthode, les billes à base de cellulose se lient au motif de liaison à la cellulose (CBM) fusionné au rapporteur NanoLuc qui peut ensuite être retiré de la solution. Tous les autres phages subiraient des baisses de titre, ou la luminescence résiduelle plafonnerait à des valeurs élevées inacceptables en raison d'une partie importante des protéines NanoLuc ne se liant pas aux billes et restant enzymatiquement actives. Les méthodes basées sur l'exclusion stérique telles que la filtration tangentielle se sont avérées efficaces dans ces cas et nous ont permis de traiter de gros volumes.

Dans les tests mesurant les bactéries viables, il existe généralement un compromis entre le délai de détection et la limite de détection, car les bactéries traversant une période de récupération et de croissance génèrent un signal plus élevé. On s'attend à ce que les cellules bactériennes prélevées à partir d'échantillons d'eau environnementale soient à l'état dormant car l'environnement aquatique est pauvre en nutriments et à une température inférieure à celle du tube digestif des mammifères. Lorsque les cellules bactériennes en phase stationnaire sont placées dans un milieu riche en nutriments à une température optimale, les cellules entrent d'abord dans une phase de latence, qui est une période initiale pendant laquelle les cellules s'adaptent à leur nouvel environnement et se préparent à une croissance exponentielle41. Ainsi, pour que les cellules expriment efficacement l'enzyme rapporteur, nous voulons nous assurer que les cellules sont entrées dans la phase de croissance exponentielle lorsque les protéines sont exprimées à des niveaux élevés. Sur la base d'études antérieures réalisées dans le dispositif microfluidique22, une période de récupération métabolique cellulaire de 1 à 2 heures était le minimum de temps nécessaire pour assurer une infection efficace par les phages. Puisque nous nous attendons à ce que les échantillons d'eau contiennent diverses souches bactériennes avec des temps de récupération potentiellement différents, nous avons choisi une période d'incubation de 2 h avant l'infection par le phage. Ensuite, nous avons déterminé le temps nécessaire pour observer la génération maximale du signal après l'infection par le phage. À l'aide du cocktail de 8 phages et d'une souche de laboratoire, nous observons une génération de signal maximale après une infection par un phage de 2 h qui plafonne à des temps d'infection plus longs. Puisque nous n'observons pas d'effet négatif de temps d'infection plus longs et prévoyons que les phages infectent une population bactérienne non caractérisée à partir d'échantillons environnementaux, nous avons choisi une période d'infection de 3 h, ce qui donne un temps d'incubation total de 5 h.

Nous avons évalué les performances du test et validé notre méthode de sélection des phages au début du développement en testant le test sur des échantillons du monde réel à Nairobi, au Kenya, un endroit où ce produit serait destiné à être utilisé. Cette évaluation est essentielle pour évaluer correctement les performances du cocktail et assurer la validité de notre méthode de sélection des phages. Au moment de cette évaluation, le cocktail de phages contenait quatre phages (Phi3, Phi7, RB69 et T7). Avec seulement 4 phages, le test a très bien fonctionné sur ces échantillons environnementaux, détectant moins de 10 E. coli MPN/100 mL. De plus, nous avons observé peu de signal sur le fond pour les échantillons contenant 1 UFC de coliformes thermotolérants ou moins, indiquant que le test est spécifique pour E. coli. Ensemble, les résultats ont démontré que notre bibliothèque interne d'E. coli nous permet de sélectionner des phages avec des gammes d'hôtes qui ne sont pas seulement spécifiques à notre bibliothèque d'E. coli et qui infecteront un large éventail de bactéries. Sur la base de ces résultats, nous avons poursuivi le développement du cocktail de phages et du test. Notez qu'aucun effet inhibiteur n'a été observé lors de l'ajout progressif de nouveaux phages au cocktail ; ainsi, un cocktail avec un nombre plus élevé de phages est souhaitable car il augmente les chances de trouver des souches sensibles d'E. coli dans un échantillon d'eau.

Des échantillons d'eau ont été prélevés dans une station d'épuration locale pour valider davantage les performances du test basé sur les phages et la composition du cocktail de phages sur des échantillons bactériens complexes et le dispositif à puce microfluidique. Ces résultats montrent que la méthode détecte les cellules bactériennes E. coli jusqu'à 6 E. coli MPN, en 5,5 h (temps total, y compris les périodes d'incubation, la filtration et les étapes de concentration du rapporteur), mesurée par rapport à la méthode de référence Quanti-Tray/2000. De plus, le signal varie linéairement avec le nombre de bactéries, qui peut être adapté à une courbe d'étalonnage. Cela permet de déterminer les niveaux de contamination, < 1 E. coli MPN/100 mL (aucune à très faible contamination), 1 à 10 E. coli MPN/100 mL (faible contamination), 10 à 100 E. coli MPN/100 mL (contamination élevée) et > 100 E. coli MPN/100 mL (très forte contamination). Cette courbe d'étalonnage dépend de la qualité des réactifs phagiques (titre, pureté) et devrait être déterminée pour chaque lot de production de cocktail de phages.

Pour être utilisé avec le dispositif à puce microfluidique, notre laboratoire a conçu un instrument permettant à un utilisateur avec une formation minimale d'exécuter le test basé sur les phages. La conception de l'instrument et du logiciel ont été mis à disposition dans notre publication précédente par Alonzo et al.22. Avec cet instrument, nous proposons une solution complète pour mesurer spécifiquement moins de 10 E. coli MPN/100 ml viables, sur le terrain, en 5,5 h tout en différenciant les niveaux de contamination bactérienne E. coli pertinents inférieurs à 1/100 ml, entre 1 et 10/100 ml, entre 10 et 100/100 ml et supérieurs à 100/100 ml, à des coûts similaires aux kits de test de terrain existants.

Pour faciliter l'accès à distance, les prototypes peuvent tenir dans une petite valise Pelican de la taille d'un bagage à main, sont légers et peuvent fonctionner sur batterie. La poursuite du développement du prototype d'instrumentation pour ajouter l'automatisation et augmenter le débit permettra des tests dans des endroits éloignés par des utilisateurs peu formés. Des efforts de développement supplémentaires sur la stabilité et l'emballage des réactifs, en particulier la lyophilisation des solutions de phages et de substrats, sont intéressants pour améliorer la perspective d'un système portable. Il sera nécessaire de tester le test sur des eaux naturelles dans divers endroits pour affiner la sélection des phages afin de produire une composition de cocktail robuste et d'atteindre une sensibilité et une spécificité élevées. Alternativement, des modifications génétiques dirigées des composants de queue de phage impliqués dans l'événement de liaison initial ont élargi avec succès la gamme d'hôtes42. Ces stratégies peuvent également être utilisées pour concevoir des bactériophages spécifiques visant à détecter d'autres agents pathogènes et indicateurs dans d'autres échantillons liquides tels que l'urine ou les boissons.

Notre collection bactérienne se compose de 339 souches d'E. coli, dont 72 souches représentant la bibliothèque ECOR33 achetées à la Michigan State University, 116 souches achetées au centre de référence E. coli du Penn State University College of Agricultural Sciences et 151 souches isolées à partir d'échantillons d'eau prélevés dans des pays à revenu faible ou intermédiaire (PRFI) à partir de diverses sources d'eau (rivières, puits et eaux stagnantes). Les échantillons d'eau collectés à partir du LMIC ont été filtrés à travers des membranes de 0,45 µm (Millipore HAWP04700) qui ont ensuite été placées sur des plaques de milieu sélectif MLGA (Sigma # 39734) et incubées à 30 ° C pendant 4 h, suivies de 18 h à 37 ° C. Jusqu'à 10 colonies d'E. coli par source d'eau ont été recueillies et striées pour les isoler d'éventuels contaminants. Les souches sélectionnées ont été cultivées dans du TSB (bouillon de soja trypique) et stockées à - 80 ° C.

Notre collection de phages se compose de 92 phages lytiques, dont 39 phages achetés à l'Université Laval, QC et 53 coliphages (étiquetés TH-#) isolés d'échantillons d'eaux usées prélevés dans une usine locale de traitement des eaux (comté de King, ministère des Ressources naturelles et des Parcs, division du traitement des eaux usées) tel que décrit précédemment43. En bref, les eaux usées brutes (25 ml) ont été mélangées avec 2 × LB (bouillon Luria) (25 ml) et une culture d'une nuit de cellules hôtes E. coli (500 µl) dans un flacon de 150 ml. Après une nuit d'incubation (37 ° C, 250 tr / min), une centrifugation (3000 × g, 10 min) et une filtration (0, 22 µm) de la culture, le surnageant a donné un lysat de phage qui a ensuite été purifié sur plaque trois fois sur la souche hôte d'origine pour produire un stock de phage homogène. Les génomes des phages isolés ont été entièrement séquencés dans un Illumina Miseq comme décrit ailleurs43. Les phages ont été déposés dans la collection Nugen de l'Université Cornell.

La gamme d'hôtes de chaque phage de notre collection a été déterminée par un test de plaque à double couche (LB-agar et 0,8 % de couche de gélose LB molle)44 sur un ensemble limité de bactéries composé de 36 souches de la bibliothèque ECOR (ECOR #1 à #36) et 43 bactéries isolées à partir d'échantillons d'eau environnementale.

Les enzymes de restriction, l'ADN ligase T4, le mélange maître d'assemblage d'ADN NEBuilder HiFi et les cellules E. coli compétentes NEB 5-alpha ont été commandés auprès de New England Biolabs, Inc. Les oligonucléotides utilisés dans cette étude ont été synthétisés par IDT. Le plasmide exprimant S. pyogenes Cas9 (pCas9) a été gracieusement offert par Sam Nugen, Cornell University. Le plasmide exprimant le gène NanoLuc® Luciferase optimisé en codons d'E. coli lié à un CBM2a45 C-terminal via un lieur flexible (pUC57-NanoLuc) et les plasmides exprimant 3 × gRNA, ciblant des régions spécifiques du phage, ont été synthétisés par GenScript. Les séquences de phages ont été soit téléchargées à partir du NCBI, soit séquencées en interne sur un Illumina MiSeq, comme décrit ailleurs43. Les séquences ont été assemblées à l'aide du logiciel Geneious (version 11.1.5, Biomatters Ltd., Auckland, Nouvelle-Zélande)46 et ont été comparées à d'autres génomes à l'aide de NCBI BLAST47, PSI-BLAST48 et Clustal Omega49.

L'ingénierie des phages a été réalisée in vivo, en utilisant le système CRISPR-Cas9 tel que décrit précédemment dans une souche compétente en recombinaison homologue50. Le plasmide donneur spécifique du phage a été généré par clonage en deux étapes dans NEB 5-alpha. Tout d'abord, 600 à 1500 pb de régions d'homologie gauche et droite (LHR et RHR) ont été amplifiées à l'aide d'ADN de phage comme matrice et ont été clonées en amont et en aval de la cassette NanoLuc-CBM à l'aide du protocole de mélange d'assemblage NEBuilder HiFi. La séquence de tête d'ARNr fonctionnel et la cassette d'ARNg 3 × ont ensuite été clonées dans leur plasmide respectif spécifique au phage pour construire le plasmide donneur final. Toutes les paires d'amorces et les séquences d'ARNg utilisées sont répertoriées dans les tableaux S1 et S2. 100 ng de pCas9 et de plasmide donneur spécifique au phage ont été soumis à une électroporation séquentielle dans DY331 en utilisant des conditions standard. La souche DY331 transformée avec succès a été induite de manière transitoire pour les gènes rouges pro-recombinaison lambda comme décrit ailleurs51. Les souches ont ensuite été infectées avec le phage approprié (titres de 104 à 109) pour recombinaison in vivo et coulées sur gélose molle.

Nano-Glo® (Promega, Madison, WI), préparé selon les instructions du fabricant, a été uniformément pulvérisé sur les plaques et imagé pour cribler les plaques de phages recombinants incandescents. Les phages recombinants ont été prélevés dans du tampon PBS (1 ml) et des dilutions en série décuplées ont été étalées trois fois sur leur hôte respectif pour purifier les phages recombinants. Tous les phages recombinants ont été confirmés par séquençage. Pour T7, le phage rapporteur a été construit par assemblage de fragments de PCR se chevauchant du génome du phage T7 et de la cassette d'expression du rapporteur. Chaque fragment adjacent a une homologie ≥ 30 pb. Les amorces utilisées pour amplifier le génome de T7 et le site d'insertion de la cassette reporter sont tels que décrits précédemment52. Le phage TH07 recombinant a été sélectionné en étalant le phage de type sauvage sur une souche hébergeant un substrat d'échange allélique et en criblant les plaques incandescentes comme décrit ci-dessus.

Les phages recombinants ont été propagés en culture liquide selon les méthodes précédentes53. Des cultures d'une nuit de cellules hôtes (NEB 5-alpha) ont été diluées (1:100) dans du milieu TSB additionné de Tween 80 (0,05 %). Les cellules hôtes ont été incubées (37 ° C, 250 tr / min, OD600 = 0, 15), inoculées avec une solution mère de phage (MOI = 0, 1) et encore incubées (37 ° C, 250 tr / min, 3 à 5 h) pour produire un lysat de phage à titre élevé. Le lysat a été centrifugé (3750 × g, 10 min) pour sédimenter les débris cellulaires et le surnageant a été filtré (0,22 µm, EMD Millipore, Burlington, MA, USA) avant stockage à 4 °C. Les solutions de phages ont été purifiées pour éliminer NanoLuc exprimé lors de la propagation. Des billes de cellulose (Avicel, PH-101, ~ 50 µm, Millipore Sigma, Darmstadt, Allemagne) ont été ajoutées (5 g pour 100 mL, 30 min, 250 tr/min, 37 °C) aux lysats de phage pour lier le rapporteur et éliminées par filtration (0,22 µm) avant filtration à flux tangentiel (TFF). Des lysats de phage partiellement purifiés (50 ml) ont été ajoutés à du tampon SM (Tris-HCl 50 mM, sulfate de magnésium 8 mM, chlorure de sodium 100 mM, gélatine 0, 01%, pH 7, 5) avec 0, 05% de Tween 80 (450 ml) et placés sur le système Minimate TFF (Pall Biotech, New York, NY, USA) avec une membrane de coupure de 500 kDa. Une diafiltration continue a été effectuée jusqu'à ce que les valeurs de luminescence du rétentat atteignent un plateau. La solution de phage purifiée a ensuite été concentrée à son volume d'origine, récupérée de la membrane et stockée à 4 °C. La procédure de purification du phage T7 consistait en des lavages consécutifs de cellulose (5 g par 100 ml, filtration stérile, répétition 5 à 7 fois) jusqu'à ce que les valeurs de luminescence plafonnent. Des solutions mères de phages à titre élevé (> 109 PFU/mL) ont été traitées avec de l'azide de sodium (0,05 %) pour créer une solution mère de phages de stockage. Enfin, une solution de cocktail de phages a été préparée en mélangeant des solutions mères de huit phages dans du TSB (chacune à une concentration finale de 1:80 à partir du stock) et stockée à 4 ° C jusqu'à ce qu'elle soit prête à l'emploi. Les titres de phages étaient stables pendant au moins 6 mois.

La gamme d'hôtes des phages recombinants a été évaluée sur la bibliothèque complète d'E. coli (339 souches) dans un essai sur plaque multipuits. Une culture d'E. coli pendant la nuit (7,5 µL) a été ajoutée au TSB (117,5 µL) dans une plaque standard à 96 puits et incubée (37 °C, 1,5 h, 100 tr/min). Une solution de phage dans du tampon TSB (25 µL) à titre élevé (> 108 PFU/mL) a été ajoutée aux puits appropriés (composition finale des puits : TSB avec 10 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 50 mM Tris-HCl pH 7,5). La plaque a été incubée pendant 3 h supplémentaires, après quoi 100 µL de la culture ont été transférés dans une plaque blanche à 96 puits, mélangés 1:1 avec le substrat NanoGlo et incubés à température ambiante pendant 3 min avant lecture à l'aide d'un lecteur de plaque (BioTek Synergy H1, hauteur de lecture 1 mm, intégration 1 s).

Une culture d'une nuit d'ATCC 25922 a été diluée en série dans du PBS pour donner des solutions contenant entre 1 et 1000 bactéries E. coli/mL, tel que mesuré par la technique du nombre le plus probable (MPN) à l'aide d'un système Quanti-Tray/2000, en triple exemplaire. Chaque dilution (40 µL) a été ajoutée dans huit puits répliqués d'une plaque filtrante en PVDF à 96 puits (Corning) et filtrée pour recueillir les bactéries. Du TSB (90 µL) a ensuite été ajouté à chaque puits et la plaque a été incubée (37 °C, 2 h). La solution de cocktail de phages (10 µL) a été ajoutée aux puits appropriés et la plaque a été incubée pendant 1, 1,5, 2 ou 2,5 h. Après incubation, la solution a été filtrée et le rapporteur NanoLuc a été collecté. La solution de filtrat a été ajoutée à une plaque blanche de filtre en cellulose à 384 puits (Pall, Acroprep) et à nouveau filtrée pour recueillir et concentrer le rapporteur sur la membrane de nitrocellulose. Un substrat Nano-Glo (10 µL) a été ajouté à chaque puits et la luminescence a été mesurée comme décrit précédemment.

Un dispositif microfluidique de détection de bactéries a été conçu en interne et sous-traité pour la fabrication (HC 1101-001, Hochuen Medical Technology, Shenzhen, Chine). Une description complète du dispositif microfluidique peut être trouvée dans une étude séparée22. En bref, le dispositif se compose de deux caractéristiques fonctionnelles interconnectées : (1) une zone de filtration à faible liaison aux protéines conçue pour isoler et faire pousser des bactéries à partir d'échantillons d'eau environnementaux, suivie d'une infection de phage cocktail in situ et (2) une zone de collecte et d'activation à base de cellulose pour l'enzyme rapporteur de luminescence induite par les phages.

Des échantillons d'eau (≥ 100 ml) à Nairobi, au Kenya, ont été prélevés dans la rivière Ngong le long de la région de Mukuru Kayaba et transportés vers un laboratoire voisin. Des échantillons d'eaux usées (≥ 100 ml) ont été prélevés dans une installation locale. La turbidité a été mesurée à l'aide du turbidimètre HTTURB® (Wagtech Projects Ltd., Thatcham, Royaume-Uni), et les échantillons ont été dilués à 1 NTU pour être traités avec le dispositif microfluidique. Les échantillons ont ensuite été dilués en série dans de l'eau distillée pour générer une gamme de concentrations cellulaires à tester. La dilution souhaitée (100 ml) a été ajoutée au milieu TSB (10 ml) sur une seringue connectée à la puce microfluidique à l'aide d'un ensemble de filtration sur mesure. Pendant le processus de filtration, un vide a été appliqué à l'orifice de sortie, ce qui a permis de capturer toutes les particules supérieures à 0,45 µm, y compris les cellules E. coli, sur une membrane PVDF. Pour augmenter l'activité métabolique des cellules isolées, la chambre du canal serpentin au-dessus de la membrane PVDF a été remplie de milieu TSB (250 µL) contenant du Tween 20 (0,1 %). La puce a ensuite été incubée dans un incubateur de laboratoire (37 °C, 2 h). Le milieu a ensuite été remplacé par une solution de cocktail de phages à > 107 (250 µL). La puce a ensuite été incubée (37 ° C, 3 h) pour permettre l'infection par le phage. Le vide a ensuite été appliqué pour transférer l'enzyme NanoLuc-CBM produite de la membrane PVDF à la membrane de capture de nitrocellulose (NT). Enfin, le substrat Nano-Glo (75 µL) a été ajouté à la chambre sous la membrane NT. La luminescence a été lue immédiatement, à l'aide d'un ensemble de détection personnalisé avec un tube photomultiplicateur (ET Enterprises, Ltd., Uxbridge, Royaume-Uni)22. Le kit de filtration sur membrane Aquasafe® WSL50 Pro (Wagtech Projects Ltd., Thatcham, Royaume-Uni) a été utilisé pour quantifier les UFC dans les échantillons de rivière, et le système Quanti-Tray/2000 (IDEXX, Westbrook, ME) a été utilisé pour déterminer le NPP dans les échantillons d'eaux usées.

Les Nations Unies. Objectif de développement durable 6 : Rapport de synthèse sur l'eau et l'assainissement. Nations Unies https://doi.org/10.1126/science.278.5339.827 (2018).

Article Google Scholar

Groupe inter-agences des Nations Unies sur la mortalité infantile. Niveaux et tendances de la mortalité infantile. (2019).

Organisation Mondiale de la Santé. Directives pour l'eau potable. (2017). https://www.who.int/water_sanitation_health/publications/drinking-water-quality-guidelines-4-incluant-1st-addendum/en/

Odonkor, ST & Ampofo, JK Escherichia coli comme indicateur de la qualité bactériologique de l'eau : un aperçu. Microbiol. Rés. (Pavie) 4, 5–11 (2013).

Article CAS Google Scholar

Rompre, A., Servais, P., Baudart, J., De-Roubin, M.-R. & Laurent, P. Détection et dénombrement des coliformes dans l'eau potable : méthodes actuelles et approches émergentes. J. Microbiol. Méthodes 49, 31–54 (2002).

Article PubMed Google Scholar

Bain, R. et al. Un catalogue récapitulatif des tests microbiens de l'eau potable pour les milieux à ressources faibles et moyennes. Int. J. Environ. Rés. Santé publique 9, 1609-1625 (2012).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Nurliyana, M. et al. La méthode de détection d'Escherichia coli dans les ressources en eau : un bilan. J. Phys 995, 12065 (2018).

Google Scholar

UNICEF. UNICEF TPP : Détection rapide d'E. coli v3. 1–16 (2019). https://www.unicef.org/innovation/sites/unicef.org.innovation/files/2020-10/Rapid-coli-detection-TPP-2019.pdf

Richter, Ł, Janczuk-Richter, M., Niedziółka-Jönsson, J., Paczesny, J. & Hołyst, R. Progrès récents dans les méthodes basées sur les bactériophages pour la détection des bactéries. Découverte de drogue. Aujourd'hui 23, 448-455 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Paczesny, J., Richter, Ł & Hołyst, R. Progrès récents dans la détection de bactéries à l'aide de bactériophages : une revue. Virus 12, 845 (2020).

Article CAS PubMed Central Google Scholar

Ackermann, H.-W. & DuBow, MS in Viruses Prokaryotes Propriétés générales des bactériophages, Vol. 1 49–85 (CRC Press, 1987).

Loessner, MJ, Rees, CED, Stewart, GSAB & Scherer, S. Construction du bactériophage rapporteur luciférase A511 :: luxAB pour une détection rapide et sensible des cellules viables de Listeria. Appl. Environ. Microbiol. 62, 1133-1140 (1996).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jain, P. et al. φ 2GFP10, un fluorophage à haute intensité, permet la détection et le test rapide de sensibilité aux médicaments de Mycobacterium tuberculosis directement à partir d'échantillons d'expectoration. J.Clin. Microbiol. 50, 1362-1369 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, S., Kim, M. & Ryu, S. Développement d'un phage rapporteur bioluminescent conçu pour la détection sensible de Salmonella typhimurium viable. Anal. Chim. 86, 5858–5864 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Alcaine, SD et al. Phage-protéase-peptide : un nouveau tiercé gagnant permettant la détection multiplex de pathogènes bactériens viables. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 8177–8185 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Alcaine, S., Pacitto, D., Sela, D. & Nugen, S. Phage & phosphatase : Une nouvelle sonde à base de phage pour une détection rapide et multiplateforme des bactéries. Analyste 140, 7629–7636 (2015).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Ripp, S., Jegier, P., Johnson, CM, Brigati, JR & Sayler, GS Détection bioluminescente amplifiée par bactériophage d'Escherichia coli O157: H7. Anal. Bioanale. Chim. 391, 507-514 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hinkley, TC et al. Un test basé sur les phages pour la visualisation rapide, quantitative et unique des UFC d'E. coli (ECOR #13) dans l'eau potable. Sci. Rep. 8, 1–8 (2018).

Article ADS CAS Google Scholar

Hinkley, TC et al. Le bactériophage rapporteur T7NLC utilise une nouvelle fusion NanoLuc::CBM pour la détection ultrasensible d'Escherichia coli dans l'eau. Analyste 143, 4074–4082. https://doi.org/10.1039/C8AN00781K (2018).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Zhang, D. et al. L'utilisation d'un nouveau phage rapporteur à base de NanoLuc pour la détection d'Escherichia coli O157:H7. Sci. Rep. 6, 33235 (2016).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hall, MP et al. Journaliste de luciférase conçu à partir d'une crevette de haute mer utilisant un nouveau substrat d'imidazopyrazinone. ACS Chem. Biol. 7, 1848–1857 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Alonzo, LF et al. Un dispositif microfluidique et des prototypes d'instruments pour la détection d'Escherichia coli dans des échantillons d'eau à l'aide d'un test de bioluminescence à base de phage. Puce de laboratoire https://doi.org/10.1039/D1LC00888A (2022).

Article PubMed Google Scholar

Ishii, T. & Yanagida, M. Organisation moléculaire de la coquille de la tête du bactériophage Teven. J. Mol. Biol. 97, 655–660 (1975).

Article CAS PubMed Google Scholar

Tanji, Y. et al. Détection d'Escherichia coli par le bactériophage T4 inactivé au lysozyme marqué à la GFP. J. Biotechnol. 114, 11-20 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Abrescia, NGA et al. Aperçu de l'assemblage à partir de l'analyse structurale du bactériophage PRD1. Nature 432, 68–74 (2004).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Parks, RJ Adenovirus protein IX : Un nouveau regard sur une ancienne protéine. Mol. Là. 11, 19–25 (2005).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Effantin, G., Boulanger, P., Neumann, E., Letellier, L. & Conway, JF La structure du bactériophage T5 révèle des similitudes avec HK97 et T4 suggérant des relations évolutives. J. Mol. Biol. 361, 993–1002 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

Tang, L., Gilcrease, EB, Casjens, SR & Johnson, JE Liaison hautement discriminatoire des protéines de cimentation de la capside dans le bactériophage L. Structure 14, 837–845 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

Duong, MM, Carmody, CM, Ma, Q., Peters, JE & Nugen, SR Optimisation de l'ingénierie du phage T4 via CRISPR/Cas9. Sci. Rapports 10, 1–9 (2020).

Google Scholar

Doudna, JA & Charpentier, E. La nouvelle frontière de l'ingénierie du génome avec CRISPR-Cas9. Science 346, 1258096. https://doi.org/10.1126/science.1258096 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F. et Marrafni, LA Édition guidée par l'ARN de génomes bactériens à l'aide de systèmes CRISPR-Cas. Nat. Biotechnol. 31, 233-239 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Callahan, DJ, Stanley, B. & Li, Y. Contrôle de la formation de particules protéiques pendant l'ultrafiltration/diafiltration grâce à la protection interfaciale. J.Pharm. Sci. 103, 862–869 (2014).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ochman, H. & Selander, RK Souches de référence standard d'Escherichia coli provenant de populations naturelles. J. Bactériol. 157, 690–693 (1984).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Garcia-Armisen, T., Prats, J. & Servais, P. Comparaison des coliformes fécaux cultivables et du dénombrement d'Escherichia coli dans les eaux douces. Peut. J. Microbiol. 53, 798–801 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hachich, EM et al. Comparaison des densités de coliformes thermotolérants et d'Escherichia coli dans les plans d'eau douce. Braz. J. Microbiol. 43, 675–681 (2012).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Numberger, D. et al. Caractérisation des communautés bactériennes dans les eaux usées avec une résolution taxonomique améliorée par séquençage d'ARNr 16S pleine longueur. Sci. Rapports 9, 1–14 (2019).

CAS Google Scholar

Koyama, K., Hokunan, H., Hasegawa, M., Kawamura, S. & Koseki, S. Le nombre de cellules bactériennes suit-il une distribution de Poisson théorique ? Comparaison de nombres de cellules individuelles obtenus expérimentalement avec la génération de nombres aléatoires via une simulation informatique. Microbiol Alimentaire. 60, 49-53 (2016).

Article PubMed Google Scholar

Burnham, S. et al. Vers une détection rapide sur site à médiation par les phages d'Escherichia coli générique dans l'eau à l'aide d'une lecture luminescente et visuelle. Anal. Bioanale. Chim. 406, 5685–5693 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Chen, J. et al. Capteurs électrochimiques à nanoparticules-enzymes pour le dépistage de la contamination bactérienne dans l'eau potable. Analyste 140, 4991–4996 (2015).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Graine, KD Lutte contre les phages : comment les bactéries se défendent contre les attaques virales. PLOS Pathog. 11, e1004847 (2015).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Wade, HE Observations sur les phages de croissance d'E. coli type américain BJ Gen. Microbiol. 7, 18–23 (1952).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ando, H., Lemire, S., Pires, DP & Lu, TK Ingénierie des échafaudages viraux modulaires pour l'édition ciblée de populations bactériennes. Cellule Syst. 1, 187-196 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hinkley, TC et al. Séquences génomiques de 38 bactériophages infectant Escherichia coli, isolés d'eaux usées brutes. Microbiol. Resour. Annoncer. 9, 1–3 (2020).

Article Google Scholar

Elizabeth, K. & Sulakvelidze, A. Bactériophages : Biologie et applications. (2005).

McLean, BW et al. Analyse de la liaison du module de liaison aux glucides de la famille 2a de Cellulomonas fimi xylanase 10A à la cellulose : spécificité et identification des résidus d'acides aminés fonctionnellement importants. Protéine Ing. Dés. Sél. 13, 801–809 (2000).

Article CAS Google Scholar

Kearse, M. et al. Geneious basic : une plate-forme logicielle de bureau intégrée et extensible pour l'organisation et l'analyse des données de séquence. Bioinformatique 28, 1647–1649 (2012).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Altschul, SF, Gish, W., Miller, W., Myers, EW & Lipman, DJ Outil de recherche d'alignement local de base. J. Mol. Biol. 215, 403–410 (1990).

Article CAS PubMed Google Scholar

Altschul, SF et al. Gapped BLAST et PSI-BLAST : une nouvelle génération de programmes de recherche de bases de données de protéines. Nucleic Acids Res. 25, 3389–3402 (1997).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sievers, F. et al. Génération rapide et évolutive d'alignements de séquences multiples de protéines de haute qualité à l'aide de Clustal Omega. Mol. Syst. Biol. 7, 539 (2011).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Tao, P., Wu, X., Tang, W., Zhu, J. & Rao, V. Ingénierie du génome du bactériophage T4 à l'aide de CRISPR-Cas9. Synthé ACS. Biol. 6, 1952-1961. https://doi.org/10.1021/acssynbio.7b00179 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yu, D. et al. Un système de recombinaison efficace pour l'ingénierie chromosomique chez Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 5978–5983 (2000).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pulkkinen, EM, Hinkley, TC & Nugen, SR Utilisation de l'assemblage d'ADN in vitro pour concevoir un phage rapporteur synthétique T7 Nanoluc pour la détection d'Escherichia coli. Intégr. Biol. 11, 63–68 (2019).

Article Google Scholar

Bactériophages. Humana Press 501, (Humana Press, 2009).

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Les auteurs remercient le Bill and Melinda Gates Foundation Trust pour leur parrainage par le biais du Global Good Fund I, LLC d'Intellectual Venture (www.globalgood.com), l'usine de traitement des eaux du comté de King South à Renton, WA USA pour avoir fourni des échantillons d'eaux usées, et le laboratoire AgriQ Quest à Nairobi pour avoir fourni un espace de laboratoire.

Luis F. Alonzo, Spencer Garing, Ethan Spencer & Anne-Laure M. Le Ny

Adresse actuelle : Global Health Labs, 14360 Eastgate Way, Bellevue, WA, 98007, États-Unis

Paras Jain et David Bell

Adresse actuelle : Cell Therapy and Cell Engineering Facility, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY, 10065, États-Unis

Sam Nugen

Adresse actuelle : Consultant indépendant, Issaquah, WA, 98027, États-Unis

Laboratoire des entreprises intellectuelles, 14360 SE Eastgate Way, Bellevue, WA, 98007, États-Unis

Luis F. Alonzo, Paras Jain, Troy Hinkley, Nick Clute-Reinig, Spencer Garing, Ethan Spencer, Van TT Dinh, David Bell, Kevin P. Nichols & Anne-Laure M. Le Ny

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LFA et A.-LLN ont rédigé le manuscrit avec le soutien de PJ, NC-R., SG et TH. PJ et TH ont fabriqué les phages recombinants. NC-R. effectué les expériences de gamme d'hôtes de phage. SG et TH ont maintenu et purifié les phages avec l'aide d'ES. ES a acquis des échantillons d'eaux usées. Le LFA a réalisé les expériences sur les puces microfluidiques. VD, DB et SN ont contribué à la planification du projet. A.-LLN a supervisé le projet avec KN Tous les auteurs ont fourni des commentaires critiques, contribué à façonner la recherche et révisé le manuscrit.

Correspondance à Anne-Laure M. Le Ny.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Alonzo, LF, Jain, P., Hinkley, T. et al. Détection rapide, sensible et peu coûteuse de la bactérie Escherichia coli dans des échantillons d'eau contaminée à l'aide d'un test basé sur les phages. Sci Rep 12, 7741 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11468-2

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Reçu : 13 décembre 2021

Accepté : 18 avril 2022

Publié: 11 mai 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-11468-2

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