L'activation de la cofiline 1 prévient les défauts d'allongement et de guidage des axones induits par l'alpha extracellulaire

Rapports scientifiques volume 5, Numéro d'article : 16524 (2015) Citer cet article

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La neurogenèse adulte altérée et les lésions traumatiques axonales participent à la sévérité des maladies neurodégénératives. L'alpha-synucléine, une protéine cytosolique impliquée dans la maladie de Parkinson, peut être libérée des neurones, suggérant un rôle de l'excès d'alpha-synucléine sécrétée dans l'apparition et la propagation de la pathologie. Ici, nous fournissons des preuves que l'exposition à long terme des jeunes neurones à l'alpha-synucléine extracellulaire entrave l'allongement des axones et la rotation du cône de croissance. Nous montrons que le renouvellement de l'actine et le taux de mouvement des ondes d'actine le long de l'axone sont modifiés, en raison de l'inactivation de la cofiline induite par l'alpha-synucléine. Lors de la rupture au laser des microfilaments, la guérison des axones est favorisée par la phosphorylation accrue de la cofiline, cependant, à des moments ultérieurs ; le défaut d'extension des neurites prévaut, étant perdu la régulation de l'activité cofiline. Il est important de noter que la surexpression de la forme active de la cofiline dans les neurones exposés à l'alpha-synucléine est capable de restaurer le mouvement des ondes d'actine, l'allongement physiologique des axones et la rotation du cône de croissance. Notre étude révèle la base moléculaire des déficits induits par l'alpha-synucléine dans la croissance et la migration des neurones nouveau-nés et dans l'allongement et la régénération des neurones adultes.

Les formes rares de la maladie de Parkinson (MP) résultant de mutations de l'alpha-synucléine (Syn) ou d'une expression accrue de Syn de type sauvage (wt) sont caractérisées par un début précoce et une transmission autosomique dominante, impliquant Syn dans la pathogenèse de la maladie1,2. Les niveaux de Syn peuvent également jouer un rôle dans la pathogenèse de la MP sporadique ; des polymorphismes nucléotidiques fortement associés à la MP et affectant les niveaux de Syn en modifiant la transcription des gènes ou la stabilité de l'ARNm, ont été récemment identifiés3,4. La détection de syn dans le liquide céphalo-rachidien et dans le plasma5 a ouvert le champ à l'étude des mécanismes non autonomes cellulaires dans la MP. Les greffons dopaminergiques sains implantés dans le striatum subissent une dégénérescence accompagnée de corps de Lewy contenant de la Syn, suggérant un rôle potentiel de la Syn extracellulaire sécrétée dans l'apparition de la maladie6,7. Une étude très récente a mis en évidence le transfert de Syn d'une inoculation intrastriée aux cellules réceptrices, conduisant à la propagation de la pathologie le long des circuits interneuronaux8. Outre l'augmentation de l'expression et de la libération de Syn due aux multiplications du gène Syn, toute forme de lésion cérébrale ou de mort cellulaire au cours de la neurodégénérescence peut favoriser la libération de Syn cellulaire monomère. Dans les modèles PD de surexpression de Syn, la perte de neurones dopaminergiques est précédée de modifications dégénératives des axones et des terminaux striataux, ce qui suggère que la pathologie induite par Syn frappe d'abord les axones et les terminaux et que les corps cellulaires sont impliqués par un mécanisme de dépérissement. Des stades distincts de la maladie peuvent être imités par l'évolution temporelle des altérations survenant chez les animaux traités avec Syn9.

Cependant, les déficits précoces du développement neuronal et de la fonctionnalité induits par la présence de niveaux élevés de Syn extracellulaire n'ont pas encore été étudiés.

La neurogenèse adulte est affectée dans le cerveau vieillissant et dans les maladies neurodégénératives10,11, augmentant la gravité de la pathologie due à la perte neuronale. Une diminution de la neurogenèse hippocampique a été constatée chez les patients atteints de MP et les modèles animaux de MP12,13,14. L'allongement et le guidage des axones sont des processus fondamentaux pour une migration, une intégration et une connectivité correctes des neurones en développement, processus qui sont finement réglés par le renouvellement de l'actine et l'activité des protéines de liaison à l'actine.

L'interaction entre Syn et l'actine a été suggérée par une co-localisation observée dans deux lignées cellulaires neuronales15 et par la dérégulation des niveaux d'actine observée chez D. melanogaster et dans les modèles C. elegans de PD16,17. Il a été démontré que Syn interagissait directement avec l'actine in vitro et affectait la dynamique de l'actine dans les cellules vivantes et les neurones en culture18. Le monomère extracellulaire Syn à haute dose, en tant que forme mutante A30P de Syn, s'est avéré altérer la dynamique de l'actine par la stabilisation des microfilaments médiée par la phosphorylation de la cofiline 119. Un équilibre altéré de l'activité de la cofiline 1 en raison d'une dérégulation des kinases et des phosphatases qui contrôlent l'état de phosphorylation de la cofiline 1 a été associé à la neurodégénérescence. Une augmentation de l'inactivation/phosphorylation de la cofiline 1 avec l'âge et dans la maladie d'Alzheimer a été constatée en raison de l'inactivation des phosphatases Slingshot 120. Il a été démontré que le peptide bêta-amyloïde diminuait la phosphorylation de la cofiline à faibles doses, favorisant la formation de bâtonnets d'actine21 et inactivait la cofiline via la voie LIM domain kinase (LIMK) à des doses plus élevées, contribuant à la polymérisation de l'actine22. L'absence de sérine/thréonine-protéine kinase répétée riche en leucine (LRRK), ou de LRRK mutant incapable de se lier à la protéine kinase A (PKA), a augmenté la phosphorylation dépendante de la PKA de la cofiline, entraînant une synaptogenèse et une transmission anormales23.

Ici, nous montrons que les neurones de l'hippocampe en culture exposés à wt ou A30P mutant Syn ont un allongement axonal défectueux et une rotation du cône de croissance émoussée, tandis que le renouvellement de l'actine est diminué et que l'activité de la cofiline 1 est altérée. Tous les défauts associés au cytosquelette dans le développement axonal induits par Syns peuvent être prévenus par l'activation de la cofiline 1. Nous proposons un mécanisme par lequel le câblage précis des réseaux de neurones, à la fois dans les neurones en développement dans les domaines de la neurogenèse adulte et dans les connexions établies matures, est perdu aux premiers stades de la neurodégénérescence induite par Syn. Ainsi, les voies régulatrices de la cofiline 1 pourraient constituer une cible efficace pour le traitement de la MP.

Nous avons précédemment montré que Syn module physiologiquement l'assemblage de l'actine, une activité qui est profondément altérée chez le mutant Syn A30P18 et que des niveaux élevés de Syns extracellulaire soluble, à la fois wt et forme mutante A30P, étaient également capables d'affecter la dynamique de l'actine, stabilisant les microfilaments19. Pour évaluer l'effet chronique de Syns présent dans le milieu extracellulaire, nous avons incubé des neurones hippocampiques embryonnaires immédiatement après la dissection avec 5 μM de wt recombinant humain purifié ou A30P Syn pendant 2 jours. Les protéines purifiées ne contenaient aucune forme agrégée ou clivée et montraient la présence de peu d'oligomères après 2 jours d'incubation avec le milieu neuronal24. Par rapport aux échantillons témoins, dans les neurones à 2 jours in vitro (DIV) exposés à la Syns extracellulaire, une augmentation évidente des filopodes et des lamellipodes autour du corps cellulaire et du cône de croissance (Fig. 1a), indique une augmentation de l'assemblage et de la stabilisation de l'actine.

Les Syns extracellulaires diminuent la fraction mobile d'actine.

( a ) Distribution de la F-actine, révélée par une coloration fluorescente à la phalloïdine, dans 2 neurones hippocampiques embryonnaires de souris DIV incubés en l'absence ou en présence de 5 μM de wt purifié ou de A30P Syn pendant 2 jours. ( b ) Les neurones infectés par l'actine-YFP ont été blanchis le long de l'axone (panneau de gauche, carré) et imagés à 3 DIV à 1 image / 0, 6 s pendant 60 s (panneau de droite). ( c ) Courbes moyennes de récupération de la fluorescence actine-YFP après photoblanchiment au fil du temps dans les neurones traités par contrôle (bleu), wt Syn (vert) et A30P Syn (rouge), notez la valeur inférieure du plateau dans les courbes obtenues à partir des neurones traités par Syns. ( d ) Évaluation quantitative du pourcentage de fraction mobile sur la fluorescence totale et de la constante de temps de récupération de la fluorescence ( e ) dans le contrôle et dans les neurones traités avec Syns comme en ( a ). Dans (d, e), les données sont exprimées en valeurs moyennes ± SEM. Dans (c–e), ctrl, n = 19, wt Syn, n = 24 ; A30P Syn, n = 24, provenant de 3 cultures indépendantes. Signification statistique déterminée par ANOVA unidirectionnelle suivie du test de Dunnett pour comparaison multiple, *P < 0,05 ; **P < 0,01. (d) P = 0,0046, valeur alpha : 0,050 : 0,791 ; (e) P = 0,5170 ns, valeur alpha : 0,050 : 0,049). Barres en (a, b) 10 μm.

Pour comprendre si l'effet observé de Syns extracellulaire sur la morphologie et la dynamique du cytosquelette pourrait être dû à une augmentation des microfilaments stabilisés, nous avons réalisé des expériences de récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP). Le FRAP a été réalisé sur des neurones à 3 DIV infectés viralement par l'actine-YFP. La région d'intérêt (ROI) a été choisie au centre de l'axone à la même distance du corps cellulaire dans tous les neurones examinés (Fig. 1b). La récupération de l'intensité de fluorescence après photoblanchiment a été quantifiée après normalisation sur une zone témoin. La constante de temps de la récupération de la fluorescence est en corrélation avec la vitesse de polymérisation de l'actine et le plateau atteint par la fluorescence indique la fraction de filaments subissant un tapis roulant actif (Fig. 1c). La quantification de ces paramètres a montré que dans les neurones traités avec Syns, la fraction mobile avait diminué d'environ 35% par rapport au contrôle (Fig. 1d), bien que le taux d'insertion n'ait pas changé (Fig. 1e). Ces résultats suggèrent que le pool de monomères d'actine libre est faible et que l'équilibre est déplacé vers un état stable et polymérisé de microfilaments.

La perturbation ou la stabilisation du cytosquelette d'actine peut entraîner l'incapacité des axones à s'allonger et à se transformer en réponse à des signaux extracellulaires. La chambre de chimiotaxie de Dunn a été utilisée pour étudier la réponse des neurones à un gradient de chimioattractants, le puits externe contenait une solution de 20 μM de 8-bromoadénosine 3′,5′-monophosphate cyclique (8-Br-AMPc), un activateur de PKA (Fig. 2a). Les neurones ont été incubés sans ou avec wt et A30P Syn pendant 2 jours avant les expériences et ont été examinés pour leur réponse au 8-br-AMPc par imagerie en accéléré pendant 30 min. L'analyse de la direction de rotation de l'axone en présence du signal attractif a montré que, alors que les neurones témoins modifiaient leur trajectoire de croissance dans le sens de concentrations croissantes de chimioattractant, les neurones traités par Syns perdaient la capacité de suivre les signaux de guidage (Fig. 2b). La quantification de la direction de croissance des axones 30 minutes après l'application de 8-Br-AMPc indique une réponse positive de 100 % dans les neurones témoins et une réponse positive de 50 % dans les neurones traités avec Syns, ce qui indique un comportement aléatoire (Fig. 2c). Le taux de croissance des axones tournants était également significativement diminué dans les neurones traités avec wt et A30P Syn (Fig. 2d). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que la diminution du renouvellement de l'actine induite par Syns pourrait être corrélée à des déficits fonctionnels dans les neurones en développement, tels que l'allongement et la migration correcte de l'axone.

Les Syns extracellulaires entravent le guidage des axones.

( a ) Neurones cultivés sur une lamelle assemblée à l'envers sur une chambre de Dunn avec le puits extérieur rempli de 40 μM de 8-br-AMPc cyclique qui forme un gradient par diffusion. Les neurones ont été imagés à 1 image/min pendant 30 min, les images sont montrées à 0 min et à 30 min à partir de l'application du gradient (barre grise en haut). ( b ) Parcelles de trajectoire d'axones en croissance exposés à un gradient de signal attractif pendant les 30 minutes de l'expérience dans des neurones traités par ctrl, wt et A30P Syn à 2 DIV. La source de chimioattractant se trouve en haut des parcelles. La direction initiale de l'axone était alignée avec l'axe horizontal. ( c ) Évaluation quantitative du pourcentage d'axones se tournant vers le gradient d'attraction dans les neurones traités comme en ( b ). Les données des neurones de chaque expérience ont été regroupées et une analyse statistique a été effectuée en comparant les données d'expériences indépendantes. ( d ) Évaluation quantitative de l'élongation des axones pendant 30 min dans des neurones traités avec ou sans wt ou A30P Syn. Dans (c, d), les données sont exprimées en valeurs moyennes ± SEM. En (c), ctrl, n = 30 ; poids Syn, n = 17 ; A30P Syn, n = 18, de 3 cultures indépendantes. Dans d ctrl, n = 20; poids Syn, n = 14 ; A30P Syn, n = 12, provenant de 3 cultures indépendantes. La signification statistique a été déterminée par ANOVA unidirectionnelle suivie du test de Dunnett pour comparaison multiple, *P < 0,05 ; ***P < 0,001. (c) P = 0,0001, valeur alpha : 0,050:1,000 ; (d) P = 0,0424, valeur alpha : 0,050 : 0,450) Barre en a : 10 μm.

Dans les neurones en croissance, les ondes d'actine se déplacent du corps cellulaire au cône de croissance pour faciliter la croissance de l'axone. Nous avons utilisé la vitesse des ondes d'actine comme paramètre de la dynamique des neurites ; en effet les ondes d'actine sont plus fréquentes et plus rapides dans les neurones au début de la DIV. Au cours de l'imagerie accélérée des neurones à 2 DIV, des structures en forme de cône de croissance se déplaçant du corps cellulaire à l'extrémité de l'axone étaient clairement visibles (Fig. 3a). Les ondes d'actine contenaient de l'actine et de la cofiline 1, une protéine de liaison à l'actine, tandis que les microtubules, présents au centre de l'axone, étaient absents des ondes d'actine (Fig. 3b). Les neurones incubés avec ou sans Syns ont été imagés à 1 image/2 min et la vitesse des ondes d'actine a été déterminée en calculant le temps mis par l'onde pour atteindre la pointe du cône de croissance, normalisé pour la longueur de l'axone (Vidéo supplémentaire 1). Par rapport aux échantillons témoins, les neurones exposés à la Syns extracellulaire pendant 2 jours ont montré une diminution d'environ 20 % de la vitesse des ondes d'actine (Fig. 3c), même s'ils semblaient en bonne santé et présentaient des cônes de croissance dynamiques. Nous avons précédemment montré que les Syns extracellulaires agissent indirectement sur la dynamique de l'actine via l'inactivation de la cofiline 1, favorisant la stabilisation des filaments d'actine19. Ainsi, nous nous sommes demandé si la cofiline 1 était dans son état inactif après une exposition chronique à Syns. Les neurones ont été exposés à Syns pendant 2 jours et le niveau de cofiline 1 phosphorylée et inactive a été quantifié par immunoblot (Fig. 3d). Le niveau de cofiline 1 phosphorylée a en effet été multiplié par 1, 8 dans les neurones incubés avec wt Syn et par 2 dans les neurones incubés avec A30P Syn par rapport au témoin (Fig. 3e). L'étude de la localisation de la cofiline 1 inactive a été réalisée en soustrayant les zones immunofluorescentes de phospho-cofiline 1 des zones colorées par la cofiline 1 fluorescente dans les neurones traités ou non avec Syns pendant 2 jours (Fig. 3f). Les images de soustraction ont révélé des zones de phospho-cofiline 1 enrichie où la coloration était absente et en particulier les ondes d'actine ne montraient aucune coloration dans les neurones traités par Syns (Fig. 3f, panneaux du milieu et du bas, flèches), suggérant que, par inactivation de la cofiline 1, le cytosquelette d'actine a perdu sa dynamique à l'intérieur des ondes d'actine. Pour évaluer davantage la corrélation entre la vitesse des ondes d'actine et l'état de polymérisation du cytosquelette, nous avons utilisé des médicaments qui modulent l'assemblage de l'actine. Les neurones ont été exposés au Jasplakinolide (Jaspla), un stabilisateur de microfilaments et à Latrunculin A (LatA), une protéine séquestrant les monomères, pendant 20 min, les médicaments ont été lavés et les neurones ont été imagés pendant 3 h. En effet, après le traitement avec Jaspla, la vitesse des ondes d'actine a été réduite de 20 %, de manière similaire à l'effet Syn et lors du traitement LatA, la vitesse des ondes d'actine était plus élevée (Fig. 3g), ce qui suggère que la dépolymérisation fait éclater le mouvement des ondes d'actine.

En présence de Syns, les ondes d'actine se déplacent plus lentement et contiennent une concentration plus élevée de p-cofiline 1.

( a ) Images accélérées d'un neurone hippocampique embryonnaire de 2 DIV montrant une onde d'actine qui va du corps cellulaire au cône de croissance. Les neurones ont été imagés à 1 image toutes les 2 min pendant 3 h. ( b ) Analyse de fluorescence du neurone à 2 DIV coloré avec de la phalloïdine (F-actine) et des anticorps dirigés contre la tubuline et la cofiline 1. L'actine et la cofiline 1 sont présentes dans la vague (flèches) tandis que la tubuline est exclue. ( c ) Quantification de la vitesse des ondes d'actine calculée sur des neurones traités avec ou sans wt ou A30P Syn pendant 2 jours et imagés comme en ( a ). ( d ) Immunoblots représentatifs montrant les niveaux de protéines indiqués à droite dans les homogénats cellulaires de neurones traités avec ou sans wt ou A30P Syn. L'actine est indiquée comme étalon interne. ( e ) Quantification du rapport entre les bandes de p-cofiline 1 et de cofiline 1, analysées par densitométrie et normalisées au niveau de l'actine, pour chaque condition expérimentale indiquée en ( d ). ( f ) Analyse de fluorescence de neurones incubés pendant 2 jours avec ou sans wt ou A30P Syn et traités pour la cofiline 1 et la p-cofiline 1. Dans les panneaux de droite sont présentées des images dérivées de la soustraction de la zone colorée pour la p-cofiline 1 de la zone colorée pour la cofiline 1. ( g ) Quantification de la vitesse des ondes d'actine calculée sur les neurones traités avec ou sans 2 μM LatA pendant 20 min nM Jaspla pendant 20 min. Dans (c, e, g), les données sont exprimées en valeurs moyennes ± SEM. En c, ctrl, n = 59 ; poids Syn, n = 60 ; A30P Syn, n = 76, provenant de 5 cultures indépendantes. En (e), n = 3 expériences indépendantes. En (g), ctrl, n = 74 ; LatA, n = 20 ; Jaspla, n = 23, de 3 cultures indépendantes. La signification statistique a été déterminée par ANOVA unidirectionnelle suivie du test de Dunnett pour comparaison multiple, *P < 0,05 ; **P < 0,01. (c) P = 0,0012, valeur alpha : 0,050 : 0,890 ; (e) P = 0,0086, valeur alpha : 0,050 : 0,477 ; (g) P = 0,0012, valeur alpha : 0,050 : 0,897). Barres en (a, f) 10 μm, en (b) rangée supérieure, 10 μm, rangée inférieure, 2 μm.

Les traumatismes cérébraux et les lésions des neurones sont une affection qui aggrave les symptômes de la MP. Le cytosquelette d'actine est impliqué dans la réparation et la régénération des axones blessés, nous nous sommes donc demandé si Syns interférerait avec le processus de guérison. Un laser UVA pulsé sub-nanoseconde a été utilisé pour créer une lésion partielle des axones de manière hautement contrôlée et reproductible. La faible puissance du laser (1,8 μW) induit un amincissement de l'axone sans ablation complète de la membrane neuronale (Fig. 4a, tache rouge et Vidéo supplémentaire 2) et une perturbation localisée des trois éléments du cytosquelette axonal25. L'axone et le cône de croissance qui ont rétréci après la lésion ont retrouvé leur forme d'origine en peu de temps et en quelques minutes, les ondes d'actine ont commencé à se déplacer sur la lésion en se dirigeant vers le cône de croissance (Vidéo supplémentaire 3). La vitesse d'onde à l'état d'équilibre en l'absence ou en présence de Syns a été utilisée pour comparer la dynamique des neurones blessés et non blessés.

Les Syns favorisent le mouvement des ondes d'actine après une lésion axonale.

( a ) Neurone à 2 DIV avant (panneau de gauche) et après (panneau du milieu) blessure par laser UVA (point rouge). Dans les panneaux de droite est montré un grossissement de la zone de la lésion avant (en haut) et après (en bas) la blessure. ( b ) Quantification de la vitesse des ondes d'actine dans les neurones blessés traités avec ou sans wt ou A30P Syn pendant 2 jours et imagés comme sur la Fig.3a. ( c ) Analyse de fluorescence (pile Z d'images confocales) de neurones hippocampiques embryonnaires avant (panneaux de gauche), après 20 min de LatA 2 μM (panneaux du milieu) et après 2 h de lavage du médicament (panneaux de droite) et colorées avec de la phalloïdine (F-actine) (rouge) et des anticorps contre la cofiline 1 (bleu) et la p-cofiline 1 (vert). ( d ) Quantification du rapport entre l'intensité de fluorescence de la p-cofiline 1 et de la cofiline 1, pour chaque condition expérimentale indiquée en ( c ). ( e ) Immunoblots représentatifs montrant les niveaux de protéines indiqués à droite dans les homogénats cellulaires de neurones traités avec ou sans LatA 2 μM pendant 20 min et après 2 h de lavage du médicament. L'actine est indiquée comme étalon interne. ( f ) Quantification du rapport entre les bandes de p-cofiline 1 et de cofiline 1, analysées par densitométrie, pour chaque condition expérimentale indiquée en e. ( g ) Quantification de l'élongation des axones pendant 16 h dans des neurones traités avec ou sans wt ou A30P Syn pendant 2 jours et blessés par laser UVA. Dans (b, d, f, g), les données sont exprimées en valeurs moyennes ± SEM. En (b), ctrl, n = 30 ; poids Syn, n = 35 ; A30P Syn, n = 32, de 3 cultures indépendantes. En (d), n = 5 pour chaque condition de 3 cultures indépendantes. Dans (f), n = 3 expériences indépendantes. En (g), ctrl, n = 25 ; poids Syn, n = 18 ; A30P Syn, n = 13, de 4 cultures indépendantes. La signification statistique a été déterminée par ANOVA unidirectionnelle suivie du test de Dunnett pour comparaison multiple, *P < 0,05 ; **P < 0,01. (b) P = 0,2956, ns, valeur alpha : 0,050 : 0,083 ; (d) P = 0,0043, valeur alpha : 0,050 : 0,942 ; (f) P = 0,0316, valeur alpha : 0,050 : 0,683 ; (g) P = 0,0141, valeur alpha : 0,050 : 0,659). Barres dans (a) panneau du milieu, 10 μm, panneau de droite, 1 μm, dans (c) 20 μm.

Dans les neurones témoins, la lésion induit une légère diminution de la vitesse des ondes d'actine. De manière inattendue, dans les neurones traités avec wt et A30P Syn, la vitesse des ondes d'actine après la lésion était similaire au témoin (Fig. 4b), mais significativement plus élevée par rapport à la vitesse des ondes d'actine dans les neurones traités avec Syns, non lésés (Fig. 3c). Il est concevable que, dans une condition dans laquelle l'actine devient résistante à la dépolymérisation et les microfilaments sont stabilisés, comme c'est le cas en présence de Syns, le pool de monomères d'actine nécessaire pour le tapis roulant à filaments actifs est pauvre, conduisant à un mouvement lent des ondes d'actine. En cas de rupture locale des microfilaments, comme après une blessure, le pool de monomères est localement restauré favorisant une polymérisation active.

Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons traité des neurones avec LatA. LatA, induisant la dépolymérisation de l'actine, pourrait représenter une condition imitant la lésion, bien que non localisée, mais impliquant l'ensemble de l'axone. Nous avons montré que la vitesse des ondes d'actine était plus élevée lors du traitement avec LatA (Fig. 3g) et nous avons demandé quelle pourrait être la cible commune pour Syns et LatA qui peut favoriser le processus de guérison. Une dépolymérisation généralisée, telle qu'induite par LatA, pourrait éventuellement activer un mécanisme de rétroaction dans les cellules, visant à sauver la morphologie des microfilaments. Lorsque LatA a été appliqué sur les neurones pendant 20 min, il a été observé une augmentation du niveau de cofiline 1 phosphorylée, qui est revenue aux conditions de contrôle après 2 h après le lavage du médicament, évidente dans l'immunocoloration (Fig. 4c, d) et dans l'immunoblot de p-cofiline 1 (Fig. 4e, f). L'inactivation de la cofiline 1, qui favorisera la polymérisation des microfilaments, expliquerait l'augmentation de la vitesse des ondes d'actine en présence du médicament, et, de même, en présence de Syns après que les microfilaments aient été dépolymérisés par la lésion induite par laser. L'effet protecteur aigu de Syns dû à l'inactivation de la cofiline 1 n'exclut pas une éventuelle altération de l'allongement des axones après une blessure à des moments ultérieurs. Les neurones ont été incubés avec Syns après placage, à 2 DIV, l'axone a été blessé comme ci-dessus et les neurones ont été imagés pendant 16 h. L'axone a été tracé et l'augmentation de longueur a été calculée entre la première et la dernière image du film (Fig. 4g). En effet, après une blessure et en présence de Syns, l'allongement était inférieur de 30 % à celui du contrôle, ce qui indique que bien que l'inactivation chronique de la cofiline 1 puisse favoriser de manière transitoire la repolymérisation des filaments perturbés, elle altère la régénération de l'axone à des moments ultérieurs.

Pour corréler l'état de phosphorylation de la cofiline 1 et donc la stabilisation du cytosquelette, avec la diminution de la vitesse des ondes d'actine induite par Syn, nous avons utilisé des constructions de cofiline 1 négatives et positives dominantes. Les neurones ont subi une électroporation avec soit la cofiline 1 de type sauvage, soit la forme mutante S3A non phosphorylable de la cofiline 1, qui est constitutivement active, soit le mutant S3E pseudophosphorylé, qui est constitutivement inactif. Les neurones électroporés avec des constructions étiquetées RFP de cofiline 1 exprimaient la protéine exogène (Fig. 5a, RFP-cofiline) en moyenne 2 à 4 fois le niveau de cofiline endogène 1, tel que calculé en tenant compte de l'efficacité de transfection, qui était d'environ 30 % à 40 %. La surexpression de la cofiline 1 S3A a induit des ondes significativement plus rapides et l'inverse était vrai dans les neurones surexprimant la cofiline 1 S3E (Fig. 5b), indiquant l'importance de la modulation de la cofiline 1 pour favoriser la motilité des ondes d'actine. Il est important de noter que la surexpression de la cofiline 1 S3A dans les neurones exposés à Syns a pu restaurer la vitesse de mouvement des ondes d'actine (Fig. 5c), équilibrant l'inactivation de la protéine par Syn.

La cofiline active 1 prévient les défauts induits par Syn dans l'allongement et la rotation des axones.

( a ) Immunoblots montrant les protéines indiquées à droite dans les homogénats de neurones électroporés avec la cofiline RFP-wt, ou la cofiline RFP-S3A, ou la cofiline RFP-S3E, ou la RFP comme contrôle. ( b ) Quantification de la vitesse des ondes d'actine dans les neurones électroporés avec des constructions comme en ( a ). ( c ) Quantification de la vitesse des ondes d'actine dans les neurones électroporés avec de la cofiline RFP ou RFP-S3A et incubés en l'absence ou en présence de wt ou A30P Syn pendant 2 jours. ( d ) Quantification de l'allongement des axones pendant 30 min dans des neurones électroporés avec de la cofiline RFP ou RFP-S3A et traités avec ou sans wt ou A30P Syn. ( e ) Quantification du pourcentage d'axones se tournant vers le gradient d'attraction dans les neurones électroporés et traités comme en ( d ). Les données des neurones de chaque expérience ont été regroupées et une analyse statistique a été effectuée en comparant les données d'expériences indépendantes. Dans (b–e), les données sont exprimées en valeurs moyennes ± SEM. La signification statistique a été déterminée par un test t bilatéral. En (b), RFP/S3A, P = 0,0176, valeur alpha : 0,050 : 0,747 ; RFP/S3E, P = 0,0381, valeur alpha : 0,050 : 0,273 ; DP, n = 41 ; wt cofiline, n = 13; S3A, n = 43 ; S3E, n = 11, de 3 cultures indépendantes. En c, RFP/wt Syn, P = 0,0226, valeur alpha : 0,050:0,547 ; RFP/A30P Syn P = 0,0191, valeur alpha : 0,050:0,181 ; wt Syn/S3A + wt Syn P = 0,0291, valeur alpha : 0,050:0,604 ; A30P Syn/S3A + A30P Syn, P = 0,0135, valeur alpha : 0,050:0,421 ; DP, n = 43 ; poids Syn, n = 17 ; A30P Syn, n = 20 ; S3A + poids Syn, n = 14 ; S3A + A30P Syn, n = 27, provenant de 3 cultures indépendantes. En d, RFP/wt Syn P = 0,0231, valeur alpha : 0,050 : 0,634 ; RFP/A30P Syn P = 0,0282, valeur alpha : 0,050:0,602 ; wt Syn/S3A + wt Syn, P = 0,0035, valeur alpha : 0,050:0,884 ; A30P Syn/S3A + A30P Syn, P = 0,0426, valeur alpha : 0,050:0,540 ; DP, n = 33 ; poids Syn, n = 13 ; A30P Syn, n = 13 ; S3A + poids Syn, n = 9 ; S3A + A30P Syn, n = 10, à partir de 3 cultures indépendantes. Dans e, la signification statistique a été déterminée par ANOVA unidirectionnelle suivie du test de Dunnett pour comparaison multiple, ***P < 0,001, (RFP/wt Syn, RFP/A30P Syn, P = 0,0001, valeur alpha : 0,050:1,000) et par un test t bilatéral : wt Syn/S3A + wt Syn P = 0,0012, valeur alpha : 0,05 0:0,874 ; A30P Syn/S3A + A30P Syn, P = 0,0044, valeur alpha : 0,050:0,688 ; DP, n = 43 ; poids Syn, n = 17 ; A30P Syn, n = 20 ; S3A + poids Syn, n = 14 ; S3A + A30P Syn, n = 27, provenant de 3 cultures indépendantes.

Sur la base de ces résultats et pour corréler le taux de mouvement des ondes d'actine avec l'allongement axonal, nous avons testé la capacité de la cofiline 1 constitutivement active à prévenir les défauts du taux de croissance axonale. Les neurones électroporés avec la cofiline S3A 1 et exposés pendant 2 jours à Syns comme ci-dessus, ont été imagés et la longueur de l'axone a été calculée après 30 min. L'exposition de neurones transfectés par simulation à wt et A30P Syn a induit une diminution significative de l'allongement des axones comme cela a été observé dans les neurones non transfectés (Fig. 2d), l'expression de la cofiline 1 active a pu restaurer le taux de croissance physiologique en présence de Syns (Fig. 5d).

De plus, pour confirmer la corrélation entre l'effet de Syn sur l'activité de la cofiline, l'altération résultante de la dynamique du cytosquelette et la rotation du cône de croissance, nous avons évalué la capacité de la cofiline active 1 à restaurer la réponse de l'axone aux signaux attractifs, qui a été perdu en présence de Syns extracellulaire. Les neurones faussement transfectés ou exprimant la cofiline 1 S3A ont été analysés dans la chambre de Dunn lors de la création d'un gradient de 8-Br-AMPc. Alors que seulement 50% des neurones exprimant la RFP incubés avec Syns se sont tournés au hasard vers le signal attractif, l'expression de la cofiline S3A 1 a rétabli la réponse correcte et 80 à 100% des axones ont pu se tourner en suivant le gradient (Fig. 5e).

Pris ensemble, ces résultats indiquent la possibilité d'empêcher l'effet Syn d'agir sur sa protéine cible, la cofiline 1, et de rétablir la capacité des neurones à s'allonger et à migrer vers leur cible.

Dans cette étude, nous apportons la preuve que la Syn libérée de manière extracellulaire contribue aux déficits d'allongement et de guidage des axones qui sous-tendent l'altération du développement neuronal et de la régénération après une blessure, participant à la gravité des maladies neurodégénératives, telles que la MP.

Nous avons précédemment démontré que la dynamique de l'actine est affectée par la présence d'un excès de wt ou d'A30P Syn dans le milieu extracellulaire, entraînant une stabilisation des microfilaments19. Ici, nous montrons que l'exposition à long terme des neurones à la Syns extracellulaire est corrélée à une diminution du renouvellement de l'actine, indiquée par le faible pourcentage d'actine mobile le long de l'axone. Les neurones sont apparus enrichis en structures d'actine, avec de grandes lamellipodes autour du corps cellulaire et à l'extrémité des neurites, rappelant l'effet induit par les médicaments stabilisateurs d'actine.

Des multiplications du gène codant pour Syn se produisent au début de PD2, 26, 27 et, de manière cohérente, des concentrations élevées de wt Syn agissaient de la même manière que Syn muté A30P, confirmant le rôle pathologique d'un excès de la protéine wt. Fait intéressant, la vulnérabilité sélective des neurones dopaminergiques de la substantia nigra vis-à-vis des neurones de l'aire tegmentale ventrale peut être corrélée à l'augmentation des niveaux de Syn trouvés dans ces neurones chez les singes et les humains âgés28.

La lésion axonale, une cause sous-jacente des troubles neurodégénératifs, déclenche des changements dans l'expression des gènes, les complexes protéiques et la relocalisation des protéines. L'enrichissement en syn dans les axones endommagés29 suggère un rôle possible dans la germination régénérative et l'orientation des cônes de croissance. La dynamique de l'actine est nécessaire pour le guidage des axones et la croissance axonale non guidée se produit en l'absence d'assemblage d'actine30. La perturbation régionale de l'actine induit le cône de croissance à se détourner de cette région et à croître dans la direction contenant les filopodes stabilisés31.

Nous rapportons que l'exposition chronique à la Syns extracellulaire ralentit l'allongement axonal à la fois pendant la croissance physiologique et pendant la repousse après lésion. Nous avons constaté que la vitesse des ondes d'actine, utilisée comme paramètre de la dynamique des neurites32, était corrélée à l'extension des axones et diminuait en présence de Syns. Il a été démontré que les ondes d'actine contiennent de l'actine et de la cofiline 1, tandis que le traitement Syns induit une accumulation de cofiline 1 phosphorylée dans les ondes d'actine. De manière constante, la vitesse des ondes d'actine a augmenté en présence du médicament dépolymérisant l'actine, LatA et a diminué en présence du médicament stabilisant l'actine, Jaspla. Après lésion axonale, les microfilaments étaient partiellement interrompus, comme le montraient nos résultats précédents25 et un déplacement de la dynamique de l'actine vers la polymérisation a favorisé la cicatrisation de la lésion, en effet la vitesse des ondes d'actine en présence de Syns était plus élevée qu'avant la lésion. Cependant, à des moments ultérieurs, la régénération de l'axone a été entravée par la diminution du chiffre d'affaires de l'actine due à la présence de Syn. La corrélation entre l'activité de la cofiline 1 et la vitesse des ondes d'actine a été évaluée avec l'utilisation de LatA. Dans une condition de dépolymérisation des microfilaments induite par LatA, de manière similaire à la situation dans l'axone blessé, la vitesse des ondes d'actine a augmenté et la cofiline 1 a été inactivée en tant que mécanisme de rétroaction. Après lavage de LatA, la cofiline 1 a été déphosphorylée pour contrôler l'état, rétablissant son activité pour équilibrer la dynamique de l'actine, tandis qu'en présence de Syns, la cofiline 1 est restée chroniquement inactive.

La cofiline 1, une protéine séparant l'actine, maintient le pool de monomères d'actine et remodèle ainsi les filaments d'actine en améliorant la dynamique d'assemblage/désassemblage33. La phosphorylation de la cofiline 1 au niveau d'un résidu sérine3 conservé par plusieurs kinases, y compris LIMK, conduit à l'inhibition de son activité de dépolymérisation de l'actine34,35. L'activité de la cofiline 1 est impliquée dans l'extension des axones et la motilité des cônes de croissance36,37,38 et dans les neurones rétiniens, la cofiline 1 agit comme une cible du facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) dans la modulation de la dynamique des filopodes39,40.

De plus, un rôle de la cofiline dans le guidage du cône de croissance a été récemment démontré en réponse aux protéines morphogéniques osseuses dans les neurones spinaux de Xenopus laevis41 et il a été démontré que le facteur de croissance nerveuse (NGF) et la nétrine-1 stimulent la protrusion de la membrane plasmique dans le cône de croissance, tout en augmentant la cofiline active. Des augmentations locales de la cofiline active ont induit une rotation attractive et une activité réduite de la cofiline a atténué la rotation vers le NGF ou la nétrine-142.

Nous avons précédemment montré que Syns induisait l'inactivation de la cofiline 1 par la voie Rac1/LIMK déclenchée par l'accumulation de protéine liée au glucose de 78 kDa (GRP78) à la surface externe de la membrane plasmique. Ici, nous fournissons la preuve que Syn, présent pendant 2 jours dans le milieu neuronal, a maintenu une phosphorylation chronique de la cofiline 1 et que dans ces neurones, la réponse du cône de croissance aux signaux attractifs a été perdue. En effet, l'expression de la cofiline 1 active dans les neurones a pu restaurer une rotation attractive du cône de croissance. De manière cohérente, l'expression de la cofiline 1 active prévenait également les déficits d'allongement des axones et de la vitesse de mouvement des ondes d'actine induites par Syns, indiquant que la cofiline 1 était la principale cible de l'activité pathologique de Syns lors du développement des neurones nouveau-nés et de la régénération des neurones lésés. L'augmentation de la mort cellulaire et la réduction de la survie des neurones nouveau-nés chez les animaux transgéniques Syn peuvent être dues à des défauts d'excroissance et d'intégration synaptique et il a été démontré que la toxicité d'une quantité croissante de Syn exerce ces effets pathologiques12.

De plus, le lien entre l'activité de la cofiline 1 et les neurotrophines, dont il a également été démontré qu'elles restaurent le nombre et la vitesse de mouvement des ondes d'actine25, renforce l'utilisation des neurotrophines comme cible thérapeutique dans le traitement de la MP et des synucléopathies apparentées.

Tous les réactifs chimiques ont été achetés auprès de Sigma Aldrich (St. Louis, MO) et GE Healthcare (Uppsala, Suède). Les boîtes de Pétri à fond de verre provenaient de Mattek Corp (Ashland, MA) et la chambre de Dunn provenait de Hawksley (Lancing, Royaume-Uni).

Anticorps monoclonaux de souris : anti-actine (Sigma Aldrich) ; anti-cofiline 1 (Abcam, Cambridge, MA). Anticorps polyclonaux de lapin : cofiline 1 anti-phosphorylée (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ; anti-b-tubuline III (Covance, Emervylle, CA).

Les anticorps secondaires Alexa Fluor conjugués à la fluorescence provenaient de Molecular Probes (Eugene, OR); des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (Bio-Rad, Hercules, CA); Phalloïdine conjuguée au FITC (Molecular Probes-Life Technologies, Carlsbad, CA).

Les ADN de pmRFP-N1 cofiline humaine wt (numéro de catalogue 50856), pmRFP-N1 cofiline humaine S3A (numéro de catalogue 50857) et pmRFP-N1 cofiline humaine S3E (numéro de catalogue 50858) (Addgene (Cambridge, MA) étaient un cadeau de James Bamburg.

Les constructions codant pour le wt humain pleine longueur ou A30P Syn inséré dans le plasmide pET21d étaient un aimable cadeau du Dr Brett Lauring (Columbia University, New York, NY, USA). Les bactéries ont été induites pendant la phase exponentielle avec 1 mM d'isopropyl-D-1-thiogalactopyranoside pendant 2 h et récoltées par centrifugation. Le culot a été solubilisé dans le tampon A (HEPES/KOH 20 mM, pH 7,2 et KCl 100 mM) et chauffé pendant 5 min à 90°C. Le lysat cellulaire a été centrifugé à 72 000 × g pendant 30 min et le surnageant a été chargé sur une colonne HiTrap monoQ Syn et a été élué avec un gradient de revêtement de KCl de 100 à 500 mM et les fractions d'intérêt ont été concentrées à l'aide d'un filtre centrifuge Centricon avant chargement sur une colonne Superose 12 dans le tampon A. Les fractions contenant Syn ont été regroupées, concentrées et stockées à -80 ° C. Pour contrôler la pureté de Syn, 1 mg de Syn purifié a été chargé au-dessus d'une colonne Superdex 75 10/300 (GE Healthcare) et élué à 0,5 ml/min sur un appareil AKTA Purifier. La densité optique (DO) a été mesurée en continu à 280 nm et 50 ng de Syn purifié ont été chargés sur un gel SDS-PAGE et colorés avec du Coomassie Brilliant Blue.

Des cultures neuronales primaires ont été obtenues à partir d'hippocampes disséqués de souris C57BL/6S E 18 (Harlan, Udine, Italie). Les animaux ont été maintenus dans une animalerie exempte d'agents pathogènes. Toutes les expériences ont été réalisées en stricte conformité avec les procédures expérimentales approuvées par le ministère italien de la Santé.

Les embryons ont été prélevés et disséqués dans des conditions stériles. Les hippocampes ont été dissociés par digestion enzymatique dans la trypsine (0,125 % pendant 30 min à 37 °C). L'activité de la trypsine a été bloquée par l'ajout de milieu complet (NeurobasalTM (Gibco) additionné de B27 (2 %, Gibco), d'alanylglutamine (2 mM, Gibco), de pénicilline/streptomycine (1 mM, Sigma) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS, Gibco). Après trypsinisation, les tissus ont été rincés dans un milieu complet sans FBS et dissociés avec une pipette en plastique. boîtes de Petri à fond de verre pour l'imagerie à long terme (densité de 20 000 neurones sur fond de verre de 10 mm de diamètre) ; ou sur lamelles de verre pour l'immunocytochimie (densité de 30 000 neurones sur des lamelles de 18 mm de diamètre) ; ou sur lamelles de verre (carré #3D) pour le test de chimiotaxie (densité de 50 000 neurones sur lamelle de 20 × 26 mm) ; ou sur boîtes de Pétri multipuits en plastique pour immunoblot (densité de 350 000 neurones sur une boîte de 30 mm de diamètre) Après 2 h de placage, 2 ml de milieu conditionné glial sans sérum ont été ajoutés.

Les cortex de souris E18 ont été disséqués et mis dans du HBSS froid puis incubés dans de la trypsine 0,125% + 1 mg/ml de DNAse pendant 15 min à température ambiante, le surnageant a été conservé et l'incubation dans de la trypsine a été répétée. Deux surnageants ont été regroupés et centrifugés pendant 5 min à 1500 rpm à 8°C. Les cellules ont été remises en suspension dans du MEM + 10 % de sérum de cheval, Pen/Strep, 33 mM de glucose et 2 mM de glutamine. Les cellules gliales ont été étalées sur des flacons T75 revêtus de 0,01 mg/ml de Poly-D-Lysine. Lorsque 100 % de confluence a été atteint, le milieu MEM a été remplacé par du milieu complet Neurobasal. Après 2 jours, le milieu conditionné glial a été ajouté aux neurones hippocampiques.

Les neurones primaires de l'hippocampe ont été électroporés en suspension immédiatement après la dissociation, en utilisant le kit Basic Nucleofector pour les neurones primaires du programme O-05 (Amaxa Biosystems, Cologne, Allemagne). Les neurones ont été électroporés avec les constructions d'intérêt (800 ng pmrfp-n1 cofiline humaine WT, 400 ng PMRFP-N1 Human Cofilin S3A, 400 ng PMRFP-N1 Human Cofilin S3E / 1 000 000 neurones) à l'unité centrale 4D-nucléofictORT (Amaxa) et décrite sur des couots de verre. Des neurones électroporés ont été utilisés à 3 DIV.

Les neurones DIV ont été lavés avec du HBSS glacé sur de la glace et grattés dans du tampon de lyse (100 μl de SDS à 1%). Les échantillons ont été bouillis pendant 2 min à 100 ° C, soniqués pendant 5 s et centrifugés pendant 15 min à 12 000 tr/min. Un tampon d'échantillon 5 × (TrisHCl 250 mM pH 6, 8, 10% SDS, 30% Glycérol 30, 5% β-mercapitaléthanol, 0, 02% bleu de bromophénol) a été ajouté à chaque échantillon de protéine. Les protéines ont été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS (PAGE) et immunotransfert.

Les neurones hippocampiques ont été étalés et traités avec wt ou A30P Syn pendant 2 jours; les incubations témoins ont été obtenues en ajoutant le tampon d'élution chromatographique. Les neurones ont été fixés avec du PFA à 4 % et colorés avec de la phalloïdine conjuguée au FITC pendant 1 heure. Les neurones traités avec 2 μM de LatA (Molecular Probes-Life Technologies) ont été fixés à 20 min et à 2 h après le lavage de Lat A. Les neurones traités avec du Jaspla 12 nM (Molecular Probes-Life Technologies) ont été fixés à 20 min. Les images confocales ont été acquises dans un microscope confocal Leica SP2, à l'aide d'un objectif Leica 63 × (NA 1.4; Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne). Toutes les images ont été analysées avec ImageJ (NIH, Bethesda, MD).

Des expériences accélérées à long terme en champ clair (jusqu'à 16 h) ont été réalisées sur un microscope inversé commercial (Eclipse Ti E; Nikon Instruments Inc.) avec autofocus à base de laser et platine motorisée pour l'acquisition d'images séquentielles multipoints. Le microscope était équipé d'une caméra à dispositif à couplage de charge (CCD) (Andor DU-897D-C00), d'un objectif Plan Fluor 40 ×, 0, 75 NA DIC et d'un logiciel d'imagerie (Nis elements AR; Nikon Instruments Inc.) Environ 10 neurones ont été imagés pour chaque condition et les images ont été prises avec un intervalle de trame de 2 min.

Pour l'imagerie accélérée à long terme, les neurones ont été maintenus à une température stable de 35 ° C dans un étage d'incubateur de cellules sur mesure adaptable au microscope inversé43. Pour maintenir le pH physiologique, un gaz de 5% de CO2 équilibré avec de l'air a été mélangé par un débitmètre (CO2BX, Okolab) et passé dans le porte-échantillon. Par ailleurs, un film d'huile (polydimethylsiloxane 200 Fluid, 0,913 g/ml, Sigma Aldrich), perméable au CO2 mais pas à l'eau, a été déposé sur les milieux de culture. Des images de neurones ont été sélectionnées par acquisition multipoint et imagées à intervalle de 1 ou 2 min par image.

La source de dissection laser était un laser Nd:YAG UV sub-nanoseconde pulsé à 355 nm (PNV001525-040, PowerChipnano-Pulse UV laser, Teem Photonics, Meylan, France). Les dommages à l'axone semblaient limités à la formation d'un col lorsque l'énergie de l'impulsion était réduite à 1,8 μW. Une ablation a été faite au milieu de l'axone44.

Les chambres de Dunn ont été prélavées avec Neurobasal puis deux fois avec un milieu conditionné glial. Du milieu conditionné a été ajouté pour remplir les puits intérieur et extérieur. La lamelle contenant les neurones a été inversée sur la chambre de Dunn, laissant une fente étroite au bord pour drainer et remplir le puits extérieur. L'excès de milieu a été éliminé par buvardage avec du papier filtre et trois côtés de la chambre de Dunn ont été scellés avec de la paraffine chaude : vaseline (1 : 1). À l'aide d'une pointe de chargement de gel, tout le liquide du puits externe a été retiré par la fente de remplissage et 40 μM de 8-br-cAMP (BioLog Life Science Institute, Brême, Allemagne) dilués dans un milieu conditionné ont été ajoutés au puits externe. La fente de remplissage a ensuite été scellée avec de la paraffine chaude et de la vaseline. La chambre de Dunn a été assemblée rapidement pour éviter les changements de pH du milieu. Après l'assemblage de la chambre de Dunn, l'imagerie a commencé immédiatement. Des images en contraste de phase en accéléré ont été acquises toutes les minutes, pendant 30 minutes, à l'aide d'un objectif 20×. Pour chaque chambre de Dunn, environ 15 positions de scène ont été imagées à divers endroits autour du pont annulaire. Le % de neurones qui se sont tournés vers le gradient a ensuite été calculé.

Les neurones hippocampiques étalés sur des boîtes de Pétri à fond de verre remplies de 2 ml de milieu conditionné glial sans sérum ont été infectés par le virus pLenti4-actine YFP à DIV 1. Les neurones ont été incubés en présence ou en l'absence de 5 μM wt ou A30P Syn pendant 2 jours. Des expériences ont été réalisées avec des neurones à 3 DIV. Les expériences FRAP ont été menées sur un microscope Leica TCS SP5 en utilisant un objectif à huile 63 × (Leica Microsystems). La région d'intérêt (ROI) a été sélectionnée et le signal d'émission acquis avec un laser de 488 nm à 20 % d'intensité, en tant que signal de pré-blanchiment. La ROI a ensuite été photoblanchie par trois lasers à 458 nm, 476 nm et 488 nm, tous réglés à 100 % d'intensité. L'acquisition post-blanchiment a été réalisée pendant 60 images à une cadence de 1 image/0,6 s. L'intensité du retour sur investissement pour chaque cadre a été normalisée à l'intensité initiale moyenne des cadres de pré-blanchiment et à la surface de l'axone blanchi. La récupération de la fluorescence a été corrigée pour le photoblanchiment indésirable survenant lors de l'imagerie en direct quantifiée dans une région de contrôle dans le champ de vision. L'intensité de la fluorescence (F) à chaque instant a été générée automatiquement par Leica Analyzing Software. L'intensité moyenne calculée dans les 5 premières trames correspond à la valeur de pré-blanchiment (Fpre), l'intensité moyenne de la 8ème trame est la valeur d'intensité (F0) après la phase de photoblanchiment survenue aux 6ème et 7ème trames.

Les parcelles individuelles de chaque expérience ont été ajustées à une fonction de modèle. La récupération de fluorescence de l'actine-YFP était mieux ajustée par une fonction à simple exponentielle (une double exponentielle n'améliorait pas significativement la qualité de l'ajustement), révélant la présence de fractions d'actine mobiles avec différentes cinétiques de récupération. Le modèle suivant a été appliqué :

- A est le % de fraction mobile de l'actine.

- B est la constante de temps de récupération de la fluorescence.

A et B ont été obtenus à partir de l'ajustement de chaque courbe. La moyenne ± SEM a été calculée pour le % de récupération de fluorescence et pour la constante de temps de récupération de fluorescence, pour chaque condition.

Le graphique final montre la valeur d'intensité de fluorescence normalisée de (F - F0)/Fpre sur l'axe Y et le temps (s) sur l'axe X. L'ajustement de la courbe a été réalisé sous Matlab. L'analyse statistique a été réalisée sur le logiciel GraphPad.

La composition et le dessin des images ont été réalisés à l'aide d'Adobe Photoshop (Adobe System, San Jose, CA). Les données ont été analysées à l'aide du logiciel GraphPad Prism (Graph Pad, La Jolla, CA) et exprimées en valeurs moyennes ± erreur standard (SEM). La signification statistique a été déterminée par ANOVA unidirectionnelle suivie du test de Dunnett pour les comparaisons multiples (les valeurs P < 0,05 ont été considérées comme significatives).

Comment citer cet article : Tilve, S. et al. L'activation de la cofiline 1 prévient les défauts d'allongement et de guidage des axones induits par l'alpha-synucléine extracellulaire. Sci. Rep. 5, 16524; doi : 10.1038/srep16524 (2015).

Kruger, R. et al. Mutation Ala30Pro du gène codant pour l'alpha-synucléine dans la maladie de Parkinson. Nat Genet 18, 106-108 (1998).

Article CAS Google Scholar

Singleton, AB et al. La triplication du locus alpha-synucléine provoque la maladie de Parkinson. Sciences 302, 841 (2003).

Article CAS Google Scholar

Simon-Sanchez, J. et al. Une étude d'association à l'échelle du génome révèle un risque génétique sous-jacent à la maladie de Parkinson. Nat Genet 41, 1308-1312 (2009).

Article CAS Google Scholar

Edwards, TL et al. Une étude d'association à l'échelle du génome confirme que les SNP dans la SNCA et la région MAPT sont des facteurs de risque courants de la maladie de Parkinson. Ann Hum Genet 74, 97-109 (2010).

Article CAS Google Scholar

El-Agnaf, OM et al. L'alpha-synucléine impliquée dans la maladie de Parkinson est présente dans les fluides biologiques extracellulaires, dont le plasma humain. Faseb J 17, 1945-1947 (2003).

Article CAS Google Scholar

Kordower, JH, Chu, Y., Hauser, RA, Freeman, TB & Olanow, CW Pathologie de type corps de Lewy dans les greffes nigrales embryonnaires à long terme dans la maladie de Parkinson. Médecine naturelle 14, 504-506 (2008).

Article CAS Google Scholar

Li, JY et al. Les corps de Lewy dans les neurones greffés chez les sujets atteints de la maladie de Parkinson suggèrent une propagation de la maladie de l'hôte au greffon. Médecine naturelle 14, 501–503 (2008).

Article ADS CAS Google Scholar

Luk, KC et al. La transmission pathologique de l'alpha-synucléine initie une neurodégénérescence de type parkinsonien chez des souris non transgéniques. Sciences 338, 949-953 (2012).

Article ADS CAS Google Scholar

Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P. & Bjorklund, A. Changements neurodégénératifs et comportementaux progressifs induits par la surexpression de l'alpha-synucléine médiée par l'AAV dans les neurones dopaminergiques du mésencéphale. Neurobiol Dis 45, 939–953 (2012).

Article CAS Google Scholar

Hamilton, A. & Holscher, C. L'effet du vieillissement sur la neurogenèse et le stress oxydatif dans le modèle murin APP(swe)/PS1(deltaE9) de la maladie d'Alzheimer. Cerveau Res 1449, 83–93 (2012).

Article CAS Google Scholar

Winner, B., Kohl, Z. & Gage, FH Maladie neurodégénérative et neurogenèse adulte. Eur J Neurosci 33, 1139-1151 (2011).

Article Google Scholar

Gagnant, B. et al. Rôle de l'alpha-synucléine dans la neurogenèse adulte et la maturation neuronale dans le gyrus denté. J Neurosci 32, 16906–16916 (2012).

Article CAS Google Scholar

Gagnant, B. et al. L'alpha-synucléine humaine de type sauvage altère la neurogenèse. J Neuropathol Exp Neurol 63, 1155-1166 (2004).

Article CAS Google Scholar

May, VE et al. La neurogenèse altérée du bulbe olfactif dépend de la présence d'alpha-synucléine humaine de type sauvage. Neurosciences 222, 343–355 (2012).

Article CAS Google Scholar

Esposito, A., Dohm, CP, Kermer, P., Bahr, M. & Wouters, FS alpha-Synucléine et ses mutants liés à la maladie interagissent différemment avec la protéine tau des microtubules et s'associent au cytosquelette d'actine. Neurobiol Dis 26, 521-531 (2007).

Article CAS Google Scholar

Xun, Z., Sowell, RA, Kaufman, TC & Clemmer, DE Expression protéique dans un modèle de drosophile de la maladie de Parkinson. J Proteome Res 6, 348-357 (2007).

Article CAS Google Scholar

Ichibangase, T. et al. Protéomique de Caenorhabditis elegans surexprimant l'alpha-synucléine humaine analysée par dérivatisation fluorogène-chromatographie liquide/spectrométrie de masse en tandem : identification de l'actine et de plusieurs protéines ribosomiques comme marqueurs négatifs aux stades précoces de la maladie de Parkinson. Biomed Chromatogr 22, 232–234 (2008).

Article CAS Google Scholar

Sousa, VL et al. La {alpha}-synucléine et son mutant A30P affectent la structure et la dynamique du cytosquelette d'actine. Mol Biol Cell 20, 3725–3739 (2009).

Article CAS Google Scholar

Bellani, S. et al. Le regroupement de GRP78 à la surface cellulaire des neurones transduit l'action de l'alpha-synucléine exogène. La mort cellulaire diffère 21, 1971-1983 (2014).

Article CAS Google Scholar

Barone, E., Mosser, S. & Fraering, PC Inactivation de la cofiline-1 cérébrale par l'âge, la maladie d'Alzheimer et la gamma-sécrétase. Loi sur la biochimie et la biophysique 1842, 2500–2509 (2014).

Article CAS Google Scholar

Maloney, MT, Minamide, LS, Kinley, AW, Boyle, JA & Bamburg, JR La protéine précurseur amyloïde clivée par la bêta-sécrétase s'accumule au niveau des inclusions d'actine induites dans les neurones par le stress ou la bêta-amyloïde : un mécanisme d'anticipation de la maladie d'Alzheimer. J Neurosci 25, 11313-11321 (2005).

Article CAS Google Scholar

Heredia, L. et al. La phosphorylation du facteur de dépolymérisation de l'actine/cofiline par la LIM-kinase médie la dégénérescence induite par la bêta-amyloïde : un mécanisme potentiel de la dystrophie neuronale dans la maladie d'Alzheimer. J Neurosci 26, 6533–6542 (2006).

Article CAS Google Scholar

Parisiadou, L. et al. LRRK2 régule la synaptogenèse et l'activation des récepteurs de la dopamine en modulant l'activité de la PKA. Nat Neurosci 17, 367–376 (2014).

Article CAS Google Scholar

Ronzitti, G. et al. L'alpha-synucléine exogène diminue la partition du radeau des canaux Cav2.2 induisant la libération de dopamine. J Neurosci 34, 10603–10615 (2014).

Article Google Scholar

Difato, F. et al. La formation d'ondes d'actine lors de la régénération après lésion axonale est renforcée par le BDNF. Rapports scientifiques 1, 183 (2011).

Article Google Scholar

Chartier-Harlin, MC et al. Duplication du locus alpha-synucléine comme cause de la maladie de Parkinson familiale. Lancette 364, 1167-1169 (2004).

Article CAS Google Scholar

Ibanez, P. et al. Relation causale entre la duplication du gène alpha-synucléine et la maladie de Parkinson familiale. Lancette 364, 1169-1171 (2004).

Article CAS Google Scholar

Chu, Y. & Kordower, JH Les augmentations d'alpha-synucléine associées à l'âge chez les singes et les humains sont associées à une déplétion de dopamine nigrostriée : est-ce la cible de la maladie de Parkinson ? Neurobiol Dis 25, 134–149 (2007).

Article CAS Google Scholar

Newell, KL et al. L'immunoréactivité de l'alpha-synucléine est présente dans les gonflements axonaux dans la dystrophie neuroaxonale et les lésions cérébrales traumatiques aiguës. J Neuropathol Exp Neurol 58, 1263-1268 (1999).

Article CAS Google Scholar

Bentley, D. & Toroian-Raymond, A. Pathfinding désorienté par des cônes de croissance de neurones pionniers privés de filopodes par un traitement à la cytochalasine. Nature 323, 712–715 (1986).

Article ADS CAS Google Scholar

Zhou, FQ, Waterman-Storer, CM & Cohan, CS La perte focale des faisceaux d'actine provoque la redistribution des microtubules et la rotation du cône de croissance. J Cell Biol 157, 839–849 (2002).

Article CAS Google Scholar

Flynn, KC, Pak, CW, Shaw, AE, Bradke, F. & Bamburg, JR Les ondes de croissance en forme de cône transportent l'actine et favorisent l'axonogenèse et la ramification des neurites. Neurobiologie du développement 69, 761–779 (2009).

Article CAS Google Scholar

Sarmiere, PD & Bamburg, JR Régulation du cytosquelette neuronal d'actine par ADF/cofiline. Journal de neurobiologie 58, 103-117 (2004).

Article CAS Google Scholar

Arber, S. et al. Régulation de la dynamique de l'actine par phosphorylation de la cofiline par la LIM-kinase. Nature 393, 805–809 (1998).

Article ADS CAS Google Scholar

Yang, N. et al. Phosphorylation de la cofiline par la LIM-kinase 1 et son rôle dans la réorganisation de l'actine médiée par Rac. Nature 393, 809–812 (1998).

Article ADS CAS Google Scholar

Meberg, PJ & Bamburg, JR Augmentation de la croissance des neurites médiée par la surexpression du facteur de dépolymérisation de l'actine. J Neurosci 20, 2459–2469 (2000).

Article CAS Google Scholar

Birkenfeld, J., Betz, H. & Roth, D. Inhibition de l'extension des neurites par surexpression de domaines individuels de la kinase LIM 1. J Neurochem 78, 924–927 (2001).

Article CAS Google Scholar

Endo, M. et al. Contrôle de la motilité et de la morphologie des cônes de croissance par la kinase LIM et Slingshot via la phosphorylation et la déphosphorylation de la cofiline. J Neurosci 23, 2527-2537 (2003).

Article CAS Google Scholar

Gehler, S., Shaw, AE, Sarmiere, PD, Bamburg, JR & Letourneau, PC La régulation du facteur neurotrophique dérivé du cerveau de la dynamique filopodiale du cône de croissance rétinienne est médiée par le facteur de dépolymérisation de l'actine/cofiline. J Neurosci 24, 10741–10749 (2004).

Article CAS Google Scholar

Chen, TJ, Gehler, S., Shaw, AE, Bamburg, JR & Letourneau, PC Cdc42 participe à la régulation de l'ADF/cofiline et des filopodes du cône de croissance rétinienne par le facteur neurotrophique dérivé du cerveau. Journal de neurobiologie 66, 103–114 (2006).

Article CAS Google Scholar

Wen, Z. et al. Les gradients de BMP dirigent les cônes de croissance nerveuse par un jeu d'équilibre entre la kinase LIM et la phosphatase Slingshot sur l'ADF/cofiline. J Cell Biol 178, 107-119 (2007).

Article CAS Google Scholar

Marsick, BM, Flynn, KC, Santiago-Medina, M., Bamburg, JR & Letourneau, PC L'activation de l'ADF/cofiline induit un cône de croissance attractif se tournant vers le facteur de croissance nerveuse et la nétrine-1. Neurobiologie du développement 70, 565–588 (2010).

Article CAS Google Scholar

Aviv, MS et al. Analyse du flux de motilité et de la navigation du cône de croissance au cours du développement neuronal in vitro par imagerie à fond clair à long terme. Journal d'optique biomédicale 18, 111415 (2013).

Annonces d'article Google Scholar

Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F. & Blau, A. Intégration de la manipulation optique et des outils électrophysiologiques pour moduler et enregistrer l'activité dans les réseaux de neurones. Journal international d'optomécatronique 5, 191–216 (2011).

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Nous remercions Brett Lauring (Columbia University, NY, NY) pour les plasmides Syn. Nous remercions également M. Pesce pour le soutien technique avec des expériences de microscopie. Ce travail a été soutenu par la Fondation Téléthon GGP10109 (à EC).

Département des neurosciences et des technologies du cerveau, Institut italien de technologie, Gênes, 16163, Italie

Sharada Tilve, Francesco Difato et Evelina Chieregatti

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ST, FD et EC ont conçu et conçu les expériences ; ST a réalisé les expériences et analysé les données ; EC a rédigé le document.

Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.

Ce travail est sous licence internationale Creative Commons Attribution 4.0. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans la ligne de crédit ; si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons, les utilisateurs devront obtenir l'autorisation du titulaire de la licence pour reproduire le matériel. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Réimpressions et autorisations

Tilve, S., Difato, F. & Chieregatti, E. L'activation de la cofiline 1 prévient les défauts d'allongement et de guidage des axones induits par l'alpha-synucléine extracellulaire. Sci Rep 5, 16524 (2015). https://doi.org/10.1038/srep16524

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Reçu : 17 août 2015

Accepté : 15 octobre 2015

Publié: 12 novembre 2015

DOI : https://doi.org/10.1038/srep16524

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