Construction d'une sous-unité | Nanning Paon Pride Co., Ltd

Rapports scientifiques volume 6, Numéro d'article : 19183 (2016) Citer cet article

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Les métallochaperones sont des protéines liant les métaux conçues pour fournir le métal approprié à une protéine cible. Le métal est généralement transféré entre différentes protéines. Dans cette étude, nous avons découvert que le métal était transféré entre la même sous-unité d'une nitrile hydratase mutante (NHase). Diverses "protéines activatrices" assurent la médiation du trafic d'ions métalliques dans les NHases. Nous avons construit des NHases de fusion en fusionnant les sous-unités β et α et/ou les "protéines activatrices" de la NHase de Pseudomonas putida. Les NHases de fusion ont montré une thermostabilité et une tolérance plus élevées à des concentrations élevées de l'amide produit. Le mécanisme d'incorporation du cobalt est passé d'un modèle d'échange de sous-unités à un modèle de chaperon moléculaire spécifique à l'apoprotéine in vivo et à un modèle de métallochaperon in vitro. Notamment, le transfert de cobalt s'est produit entre la même sous-unité α dans le motif métallochaperone. Ces résultats ont non seulement démontré la supériorité des NHases de type fusion, mais ont également révélé un modèle de transfert d'ions métalliques innovant dans la biosynthèse des métalloprotéines.

Les métalloprotéines ont été intensivement caractérisées pendant des décennies et plus d'un tiers de toutes les protéines sont des métalloprotéines1. Les rôles médiés par les ions métalliques dans les protéines comprennent le transfert d'électrons, le transport d'oxygène, la régulation des gènes et la stabilisation de la structure2. Plusieurs mécanismes généraux de la biosynthèse des métallocentres ont été rapportés dans une revue3 ; l'un d'eux est la libération par métallochaperone d'un ion métallique ou de molécules contenant un métal. Les métallochaperones sont des protéines de liaison aux métaux conçues pour délivrer l'ion métallique approprié ou les molécules contenant du métal à une protéine cible. La protéine cible et la métallochaperone sont généralement des protéines différentes et la protéine cible présente une spécificité de ligand et plus d'affinité pour l'ion métallique.

La nitrile hydratase (NHase, EC 4.2.1.84)4 est une enzyme catalysant l'hydratation d'un large éventail de nitriles en amides correspondants5. L'enzyme est composée de sous-unités α et β et contient soit un fer non héminique (Fe-NHase)6, soit un cobalt non corrine (Co-NHase)7,8. Le trafic des ions métalliques dans les NHases est médié par les "protéines activatrices" correspondantes9. Il a été démontré que les activateurs des Fe-NHases agissent comme des métallochaperones10, tandis que les "protéines activatrices" agissent comme des "chaperons d'échange de sous-unités" pour l'incorporation du cobalt dans la plupart des Co-NHases9,11,12.

L'auto-échange de sous-unités est l'une des étapes de maturation post-traductionnelle de la famille des Co-NHases11. La protéine activatrice existe sous la forme d'un complexe avec la sous-unité α de la NHase et l'incorporation du cobalt dans la NHase dépend de l'échange de la sous-unité α entre la sous-unité α sans cobalt de la NHase et la sous-unité α contenant du cobalt du complexe9. L'auto-échange de sous-unités est assez différent des mécanismes généraux actuellement connus de la biosynthèse des métallocentres9,11,13, qui ont été rapportés dans une revue par Kuchar et Hausinger3, comme suit : (i) liaison métal-ion réversible ; (ii) la libération métallochaperone d'un ion métallique ou d'un cofacteur; (iii) modification post-traductionnelle créant un site de liaison au métal ; (iv) liaison synergique d'un métal avec un autre composant ; (v) synthèse de cofacteurs contenant des métaux; (vi) incorporation de métal couplée à un transfert d'électrons ; et (vii) exigence d'un chaperon moléculaire spécifique à l'apoprotéine et ainsi de suite14. L'auto-échange de sous-unités a été découvert pour la première fois dans la L-NHase de Rhodococcus rhodochrous J19 et par la suite, dans la H-NHase de la même souche11 et on suppose qu'il se produit dans diverses autres Co-NHases et une enzyme de la famille des NHases, la thiocyanate hydrolase, qui contient également un centre unique de cobalt non corrine avec deux ligands de cystéine modifiés après la traduction12,15. Les "chaperons d'échange d'auto-sous-unités" présentent une fonction protéique surprenante contrairement aux métallochaperons dans la biosynthèse des métallocentres et aux chaperons moléculaires dans le repliement des protéines9,11.

La NHase est largement utilisée dans la production industrielle d'acrylamide et de nicotinamide4 hautement purifiés. Cependant, la plupart des NHases à haute activité sont instables lors de l'application industrielle16. Par exemple, les NHases de Pseudomonas chlororaphils B23 et Rhodococcus sp. N-774 sont stables sous 20 °C17,18 et la NHase de Rhodococcus rhodochrous J1 est simplement stable entre 10 et 30 °C19. Étant donné que l'hydratation du nitrile est une réaction exothermique, il est nécessaire de maintenir une température de réaction basse pour stabiliser les NHases par réfrigération, ce qui entraîne généralement d'énormes coûts énergétiques redondants16. De plus, la tolérance à des concentrations élevées du produit amide est nécessaire dans la fabrication industrielle. Par conséquent, une NHase plus stable avec une activité élevée et une tolérance élevée est requise pour la fabrication industrielle.

La fusion de gènes de sous-unités peut améliorer la stabilité des protéines20,21,22. La fusion de gènes est une stratégie permettant de fusionner deux ou plusieurs gènes précédemment distincts en un seul cadre de lecture ouvert. De plus, il a été rapporté que les événements de fusion ont tendance à optimiser l'assemblage en simplifiant les topologies des complexes protéiques23. Récemment, une nouvelle structure génétique de la NHase chez l'eucaryote Monosiga brevicollis a été prédite24. Les deux sous-unités NHase habituellement séparées (sous-unités β et α) sont fusionnées en un seul peptide dans cette NHase. La NHase de fusion devrait avoir des caractéristiques bénéfiques, telles qu'une activité plus élevée, une stabilité plus élevée ou de nouvelles spécificités de substrat24. Par conséquent, la stratégie de fusion de gènes pourrait être un outil efficace pour améliorer l'application de la NHase.

Dans cette étude, nous avons construit un nouveau type de NHase avec un seul polypeptide en fusionnant les sous-unités β et α de la NHase de Pseudomonas putida NRRL-18668 (P. putida). La NHase de fusion a montré une thermostabilité et une tolérance au produit significativement plus élevées que le type sauvage. La protéine activatrice P14K était également nécessaire pour l'activation de la NHase de fusion. De plus, P14K a encore été fusionné avec la NHase de fusion des sous-unités β et α, ce qui a entraîné la formation d'une autre NHase de fusion. Le mécanisme d'incorporation du cobalt de la NHase a été modifié en raison de ces altérations de structure. Le complexe α(P14K)2 (deux P14K ont été combinés avec la sous-unité α) a joué un rôle de métallochaperone pour transférer un ion cobalt dans les NHases de fusion in vitro. Le transfert de cobalt s'est produit dans la même sous-unité α entre la NHase sans cobalt (apo-NHase) et le complexe α(P14K)2, qui a révélé un modèle de transfert d'ions métalliques innovant dans la biosynthèse des métalloprotéines. De plus, P14K agit très probablement comme un chaperon moléculaire spécifique à l'apoprotéine pour l'incorporation de cobalt in vivo.

La NHase de P. putida a été précédemment construite et surexprimée avec succès dans Escherichia coli BL2125. Sur la base de la structure génétique de Monosiga brevicollis, nous avons construit deux NHases mutantes avec fusion de gènes sous-unités. Les gènes des sous-unités β et α auparavant distincts (gènes B et A) ont été fusionnés avec un lieur (dipeptide, proline-glycine) en un gène (BA); le gène fusionné (BA) a été inséré dans le plasmide pET28a, ce qui a donné pET28a-(BA) (Fig. 1a). Ensuite, le gène activateur P14K a été inséré en aval du gène mutant (BA), résultant en pET28a-(BA)P14K. Les transformants hébergeant pET28a-(BA) et pET28a-(BA)P14K ont été utilisés pour exprimer la NHase. En conséquence, l'activité NHase a été détectée et chacune des bandes protéiques correspondantes des transformants était évidente sur le SDS-PAGE, indiquant que les deux NHases de fusion ont été exprimées avec succès (Fig. 1b). Ci-après, les NHases de fusion codées par les gènes (BA) et (BA)P14K sont respectivement appelées NHase-(BA) et NHase-(BA)P14K.

Construction, expression et purification des NHases recombinantes.

(a) Organisation génétique pour la construction d'un ensemble de plasmides. (b) SDS-PAGE d'un extrait acellulaire de chaque transformant. 1, marqueur ; 2, NHase de type sauvage ; 3, NHase-(BA); 4, NHase-(BA)P14K; 5, NHase-(BAP14K). (c) SDS-PAGE des enzymes purifiées. 1, marqueur ; 2, NHase de type sauvage ; 3, NHase-(BA); 4, NHase-(BA)P14K; 5, NHase-(BAP14K).

La NHase-(BA) et la NHase-(BA)P14K ont été purifiées et caractérisées (Fig. 1c) et comparées à la NHase de type sauvage. Comme le montre le tableau 1, l'activité spécifique et le kcat de la NHase-(BA)P14K étaient supérieurs à ceux de la NHase de type sauvage, démontrant que la fusion des sous-unités β et α augmentait l'activité. La teneur en cobalt de la NHase-(BA) était d'environ 14 % de la NHase-(BA)P14K, ce qui indique que la P14K était également nécessaire pour l'incorporation du cobalt, même dans la NHase de fusion (tableau 1). La constante de Michaelis (valeur Km) de la NHase-(BA) et de la NHase-(BA)P14K était supérieure (environ 1,5 fois) à celle de la NHase de type sauvage, indiquant que la fusion des sous-unités β et α pourrait restreindre le processus de liaison du substrat au centre actif. L'analyse de masse MALDI-TOF de la NHase-(BA)P14K a indiqué que la NHase-(BA)P14K correspond à toute la longueur de βα (Fig. S1). La NHase de type sauvage est un tétramère (α2β2) ; la masse moléculaire des enzymes de fusion a été déterminée par chromatographie de filtration sur gel. Les masses moléculaires de la NHase-(BA) et de la NHase-(BA)P14K étaient respectivement de 97,8 kDa et 85,1 kDa (Fig. 2). Étant donné que la masse moléculaire calculée de la fusion βα est de 49,2 kDa, les deux NHases de fusion doivent être des dimères [(βα) 2]. À l'aide d'une analyse de spectres de dichroïsme circulaire (CD) dans l'UV lointain, nous avons effectué une comparaison détaillée de chaque propriété parmi les NHase de type sauvage, NHase-(BA) et NHase-(BA)P14K. Les spectres de la NHase-(BA) et de la NHase-(BA)P14K étaient différents de ceux de la NHase de type sauvage (Fig. 3a), ce qui indique que la structure secondaire de la NHase-(BA) ou de la NHase-(BA)P14K n'est pas la même que celle de la NHase de type sauvage.

Détermination de la masse moléculaire et des structures des NHases de fusion.

Protéines marqueurs utilisées pour la filtration sur gel : (i) glutamate déshydrogénase (levure) (290 kDa) ; (ii) lactate déshydrogénase (cœur de porc) (142 kDa); (iii) énolase (levure) (67 kDa); (iv) myokinase (levure) (32 kDa); et (v) cytochrome c (cœur de cheval) (12,4 kDa).

Spectres d'absorption CD UV lointain ( a ) et UV-Vis ( b – d ) de la NHase de type sauvage et des NHases de fusion.

P14K était nécessaire pour l'incorporation du cobalt dans la NHase de type sauvage et les NHases de fusion. Nous avons tenté de construire un gène de protéine de fusion à trois sous-unités (BAP14K), qui a ensuite fusionné P14K à l'extrémité (βα)-carboxyle de la NHase-(BA). Le gène fusionné (BAP14K) a été inséré dans le plasmide pET28a, ce qui a donné pET28a-(BAP14K) (Fig. 1a). Le transformant hébergeant pET28a-(BAP14K) a été utilisé pour l'expression de la NHase. En conséquence, la bande protéique correspondante de la NHase mutante a été détectée sur le SDS-PAGE (Fig. 1b), indiquant que la NHase de fusion a été exprimée avec succès. Ci-après, la NHase de fusion codée par le gène (BAP14K) est appelée NHase-(BAP14K). La NHase-(BAP14K) a été purifiée et caractérisée (Fig. 1c). Comme le montre le tableau 1, l'activité spécifique et le kcat de la NHase-(BAP14K) étaient supérieurs à ceux de la NHase de type sauvage et les différences d'activité spécifique et de kcat entre la NHase-(BAP14K) et la NHase-(BA)P14K étaient faibles. Par rapport à la NHase de type sauvage et à la NHase-(BA)P14K, la valeur Km de la NHase-(BAP14K) était la plus élevée, ce qui indique que la fusion de P14K restreignait davantage la liaison au substrat. La masse moléculaire de la NHase-(BAP14K) a été déterminée par chromatographie de filtration sur gel. La masse moléculaire de la NHase-(BAP14K) était de 150,6 kDa. Étant donné que la masse moléculaire calculée de la fusion βαP14K est de 67, 0 kDa, la NHase-(BAP14K) doit être dimère [(βαP14K) 2] (Fig. 2). Le spectre CD de la NHase-(BAP14K) était similaire à celui de la NHase-(BA)P14K (Fig. 3a), indiquant que la structure secondaire de la NHase-(BAP14K) est similaire à celle de la NHase-(BA)P14K mais est différente de celle du type sauvage.

Étant donné que la NHase-(BAP14K) présentait une activité NHase plus élevée que le type sauvage, nous avons étudié l'effet de la localisation P14K sur l'activité NHase de fusion. Nous avons conçu deux autres gènes NHase de fusion de trois sous-unités, (BP14KA) et (P14KBA). Dans (BP14KA), le gène P14K était situé entre les gènes des sous-unités β et α ; dans (P14KBA), le gène P14K était en avance sur le gène de la sous-unité (βα) (Fig. 1a). Les transformants hébergeant pET28a-(BP14KA) et pET28a-(P14KBA) ont été utilisés pour exprimer respectivement la NHase-(BP14KA) et la NHase-(P14KBA). Les NHases de fusion ont été purifiées et dosées. L'activité de la NHase-(BP14KA) était de 148,6 U/mg, soit environ 32 % de celle de la NHase-(BAP14K) (452,5 U/mg) ; l'activité de la NHase-(P14KBA) était de 76,7 U/mg, environ 17 % de celle de la NHase-(BAP14K). Ces résultats ont démontré que l'emplacement de P14K affectait de manière significative l'activité des NHases de fusion. Lorsque le P14K est situé en aval de l'extrémité (βα)-carboxyle, la NHase de fusion a montré l'activité la plus élevée.

L'activité spécifique et le kcat de la NHase-(BA)P14K et de la NHase-(BAP14K) étaient supérieurs à ceux de la NHase de type sauvage ; par conséquent, nous les avons ensuite comparés en termes de thermostabilité et de tolérance au produit. Les enzymes ont été incubées à 50°C dans du tampon phosphate de potassium 10 mM (KPB) (pH 7,5, contenant 0,5 mM de dithiothréitol) et l'activité de chaque NHase a été mesurée toutes les dix minutes. Comme le montre la figure 4a, les temps de demi-vie de la NHase-(BA)P14K et de la NHase-(BAP14K) étaient respectivement 2, 8 et 2 fois plus longs que ceux du type sauvage, ce qui suggère que la NHase-(BA)P14K et la NHase-(BAP14K) présentent une thermostabilité supérieure à celle de la NHase de type sauvage.

Comparaison des propriétés des NHases de fusion avec la NHase de type sauvage.

(a) L'analyse de la thermostabilité, (b) la tolérance du produit et (c) le pH optimal des NHases de fusion et de la NHase de type sauvage.

En plus de la thermostabilité, une accumulation élevée du produit est bénéfique pour la production industrielle à grande échelle, ce qui entraîne des économies d'énergie et une simplification du processus en aval19. Pour comparer la tolérance d'un amide à haute concentration du type sauvage et des enzymes de fusion, nous avons utilisé le nicotinamide pour tester la tolérance au produit des NHases. La réaction a été conduite dans 20 mM de 3-cyanopyridine (substrat) avec et sans 0,5 M de nicotinamide (produit) pendant 10 minutes. La réduction de la 3-cyanopyridine dans chaque réaction a été mesurée (Fig. 4b) et le rapport de réduction (la proportion de la quantité réduite de 3-cyanopyridine dans la réaction avec et sans nicotinamide 0, 5 M) a été calculé. Les rapports de réduction de la NHase-(BA)P14K et de la NHase-(BAP14K) étaient respectivement de 0,86 et 0,83, ce qui était supérieur à celui du type sauvage (0,80), ce qui indique que les NHases de fusion présentaient une tolérance au produit plus élevée que celle du type sauvage.

Les valeurs de pH physiologiquement optimales de la plupart des NHases varient entre 6,5 et 8,5 et la NHase de P. putida a un large maximum d'activité entre pH 7,2 et 7,826. Le pH optimal des NHases de fusion a été mesuré et comparé au type sauvage. Comme le montre la figure 4c, le pH optimal du type sauvage, NHase-(BA)P14K et NHase-(BAP14K) était de 7,5, 8,0 et 7,5, respectivement. Bien que NHase-(BAP14K) ait montré une plage stable similaire à celle du type sauvage, la plage stable de NHase-(BA)P14K était plus large, allant de 6,5 à 9,0, ce qui suggère que cette fusion pourrait élargir la portée de pH appropriée de NHase.

P14K est nécessaire pour l'incorporation du cobalt dans la NHase de P. putida12. P14K forme un complexe α(P14K)2 avec la sous-unité α de la NHase. Il est confirmé que l'incorporation de cobalt dans la NHase dépend de la substitution de la sous-unité α entre l'α(P14K)2 contenant du cobalt et l'apo-NHase, ce qui entraîne la formation de NHase12 fonctionnelle. P14K était également nécessaire pour l'incorporation de cobalt dans les NHases de fusion (tableau 1). Ici, nous avons étudié si α(P14K)2 pouvait activer les NHases de fusion. L'α(P14K)2 contenant du cobalt purifié a été obtenu en ajoutant un Strep-tag avant P14K comme décrit précédemment12 (Fig. 1a). Les NHases de fusion sans cobalt [apo-NHase-(BA), apo-NHase-(BA)P14K et apo-NHase-(BAP14K)] ont été purifiées à partir de la culture en l'absence de cobalt. La NHase apo-sauvage a également été purifiée et a été utilisée comme contrôle. L'apo-NHase de type sauvage purifiée, l'apo-NHase-(BA), l'apo-NHase-(BA)P14K et l'apo-NHase-(BAP14K) ont été respectivement mélangées avec l'α(P14K)2 contenant du cobalt purifié, puis incubées. L'activité NHase dans tous les mélanges a augmenté à mesure que le temps d'incubation augmentait et l'activité la plus élevée des NHases de fusion a été observée en 1 heure. Chaque NHase résultante [NHase de type R sauvage, R-NHase-(BA), R-NHase-(BA)P14K et R-NHase-(BAP14K)] a ensuite été purifiée à partir des mélanges et analysée. L'activité NHase de la NHase R de type sauvage était similaire à celle de la NHase de type sauvage, ce qui est conforme aux principes de l'auto-échange de sous-unités rapportés précédemment12. Fait intéressant, les activités NHase des R-NHase-(BA)P14K et R-NHase-(BAP14K) étaient respectivement de 240,5 et 219,2 U/mg, soit environ 50 % des NHases de fusion correspondantes contenant du cobalt. La R-NHase-(BA) présentait également une activité de 30 % (147,2 U/mg) des NHases de fusion contenant du cobalt (tableau 1).

L'ion cobalt est nécessaire à l'activité NHase. Les apo-NHases de fusion ont été activées par α(P14K)2. Ces résultats indiquent que l'ion cobalt a été transféré de α(P14K)2 aux apo-NHases de fusion. Pour confirmer le transfert de cobalt entre α(P14K)2 et les apo-NHases de fusion, des analyses de spectres d'absorption UV-Vis ont été réalisées. Comme le montre la Fig. 3, toutes les enzymes résultantes présentaient un épaulement supplémentaire dans la région de 300 à 350 nm (Fig. 3b) similaire à ceux des NHases (NHases contenant du cobalt) (Fig. 3c), alors que l'épaulement supplémentaire n'a pas été détecté dans les apo-NHases (Fig. 3d). Ces découvertes suggèrent que la R-NHase-(BA), la R-NHase-(BA)P14K et la R-NHase-(BAP14K) sont des enzymes contenant du cobalt. La teneur en cobalt a été déterminée, comme indiqué dans le tableau 1. R-NHase-(BA), R-NHase-(BA)P14K et R-NHase-(BAP14K) contenaient respectivement 0,23 mol ion/mol (βα), 0,61 mol ion/mol (βα) et 0,62 mol ion/mol (βαP14K). Inversement, nous avons également mélangé l'apo-NHase, l'apo-NHase-(BA), l'apo-NHase-(BA)P14K et l'apo-NHase-(BAP14K) avec l'ion cobalt et incubé. Aucune activité significative n'a été détectée dans ces mélanges (données non présentées), indiquant que les NHases de fusion ne pouvaient pas être activées par mélange avec l'ion cobalt in vitro, même pour l'apo-NHase-(BAP14K), qui contenait le fragment de P14K.

La liaison des ions métalliques est responsable de la modification post-traductionnelle des deux cystéines dans la sous-unité α de la NHase3,26. Cependant, de telles modifications n'ont pas pu être observées dans l'apo-NHase26. Ces résultats nous ont permis de supposer que les résidus de cystéine sont modifiés dans la NHase de fusion contenant du cobalt, mais pas dans l'apo-NHase. Pour clarifier l'état d'oxydation de la cystéine du site actif avant et après l'insertion du cobalt, nous avons analysé l'apo-NHase-(BA)P14K, l'apo-NHase-(BAP14K), la R-NHase-(BA)P14K et la R-NHase-(BAP14K) par NanoLC-ESI-MS/MS. Les enzymes ont été traitées avec de la trypsine après réduction et carboxamidométhylation. La masse moléculaire du peptide hydrolysé à la trypsine contenant tous les résidus de ligand métallique V351CTLCSCYPWPTLGLPPAWYK371 (VK21) a été mesurée. Dans le spectre de masse de la digestion trypsique de l'apo-NHase-(BA)P14K et de l'apo-NHase-(BAP14K) (Fig. 5a,c, à l'intérieur), nous avons constaté que le pic de masse avec m/z 1286,15 et 1285,95 respectivement correspondait à la valeur m/z de l'ion [M+2H]2+ de VK21 avec trois carboxamidométhyl (CAM-) cystéine (le m/calculé la valeur z était de 1285,94). Cependant, dans le spectre de masse de la digestion trypsique de R-NHase-(BA)P14K et R-NHase-(BAP14K) (Fig. 5b, d, à l'intérieur), nous avons constaté que le pic de masse le plus élevé avec m/z 1272,83 et 1272,82 correspondait respectivement à la valeur m/z de l'ion [M+2H]2+ de VK21 étaient tous deux avec un Cys-SO2H et deux CAM-cystéine ( la valeur m/z calculée était de 1273,44). Pour identifier le ou les résidus modifiés, nous avons effectué un séquençage MS/MS des ions avec les m/z 1286,15, 1272,83, 1285,95 et 1272,82. Les spectres étaient en bon accord avec le schéma de fragmentation prévu de VK21 avec Cys355-SO2H dans R-NHase-(BA)P14K et R-NHase-(BAP14K) et CAM-Cys355 dans apo-NHase-(BA)P14K et apo-NHase-(BAP14K). Bien que l'occurrence de la modification Cys-SOH n'ait pas été confirmée en raison de son instabilité chimique27, ces résultats suggèrent fortement que les résidus cystéine oxydés existent dans les deux NHases de fusion après l'insertion du cobalt.

Identification de Cys355-SO2H par analyse MS/MS.

Chaque ion doublement chargé correspondant au peptide VK21 de (a) apo-NHase-(BA)P14K, (b) R-NHase-(BA)P14K, (c) apo-NHase-(BAP14K), (d) R-NHase-(BAP14K) a été analysé par un système NanoLC-ESI-MS/MS. Les pics de masse avec m/z 1286,15 et 1285,95 correspondant à l'ion [M+2H]2+ du peptide VK21 avec trois CAM-cystéine (la valeur m/z calculée était de 1285,94) ont été montrés à l'intérieur de (a,c) ; les pics de masse avec m/z 1272,83, 1272,82 correspond à l'ion [M+2H]2+ du peptide VK21 avec un Cys-SO2H et deux CAM-cystéine (la valeur m/z calculée était de 1273,44) ont été montrés à l'intérieur de b,d. Les ions fragments N- et C-terminaux d'une liaison peptidique sont respectivement marqués sur la figure par b et y. Les ions b5 et b4 indiquaient clairement que la Cys355 était oxydée en acide sulfinique dans la R-NHase-(BA)P14K et la R-NHase-(BAP14K), mais pas dans l'apo-NHase-(BA)P14K et l'apo-NHase-(BAP14K). b* signifie un ion de type b après désamination et y* signifie un ion de type y après désamination.

Il a été confirmé que l'incorporation de cobalt dans la NHase de P. putida dépend de l'échange de la sous-unité α entre la sous-unité α sans cobalt de l'apo-NHase et la sous-unité α contenant du cobalt de l'α (P14K) 212 (Fig. 6a). Pour les NHases de fusion, P14K était également nécessaire pour l'activation des NHases de fusion et l'ion cobalt s'est avéré être transféré de α (P14K) 2 dans les NHases de fusion in vitro (tableau 1). Il est peu probable qu'un échange de sous-unité α se produise entre les NHases de fusion et α (P14K) 2 car la sous-unité α est fusionnée avec la sous-unité β en tant que polypeptide dans la NHase de fusion. Par conséquent, il est probable que l'ion cobalt dans la sous-unité α de α(P14K)2 ait été directement transféré dans le domaine de la sous-unité α des NHases de fusion. Dans ce processus, α(P14K)2 a probablement agi comme un métallochaperon pour le transfert d'ions cobalt. L'ion cobalt a été transféré entre les deux mêmes sous-unités α.

Mécanisme proposé d'incorporation du cobalt dans la NHase de fusion.

( a ) Échange d'auto-sous-unités pour l'incorporation de cobalt dans la NHase de type sauvage. ( b ) Transfert de cobalt de α (P14K) 2 à apo-NHase- (BA) P14K in vitro. La sous-unité apo α dans l'apo-NHase-(BA)P14K s'approche et se lie au site de reconnaissance (liaison) de P14K lors de l'auto-échange de sous-unités11, puis la sous-unité β (de l'apo-NHase-(BA)P14K) et la sous-unité α contenant du cobalt (de α(P14K)2) sont attirées par l'interaction électrostatique et s'associent pour former un complexe intermédiaire. Au lieu d'un échange de sous-unités α entre les deux protéines, un transfert direct d'ions cobalt se produit. L'oxydation des deux cystéines est responsable de la liaison du cobalt, résultant en une NHase-(BA)P14K active. (c) Incorporation de cobalt dans la fusion apo-NHase-(BA)P14K in vivo. P14K entre directement en contact avec le domaine de la sous-unité α de la protéine de fusion βα car les sites de liaison de la sous-unité α sont libres en raison de la fusion, ce qui donne un complexe intermédiaire pour l'insertion du cobalt et l'oxydation des deux cystéines. Dans ces modèles, une protéine de fusion βα est utilisée pour montrer l'apo-NHase-(BA)P14K, le changement de l'emplacement des deux arginines est utilisé pour démontrer un repliement supplémentaire après l'incorporation du cobalt.

Les ions métalliques dans la Fe-NHase et la Co-NHase sont situés dans leurs sous-unités α, qui partagent un motif de liaison métallique caractéristique (CXLC(SO2H)SC(SOH)) contenant deux résidus de cystéine oxydée : l'acide cystéine-sulfinique (Cys-SO2H) et l'acide cystéine-sulfénique (Cys-SOH)4,28,29,30. Les résidus de cystéine oxydés sont essentiels pour l'activité NHase9,31, ce qui indique que les deux résidus de cystéine dans les NHases de fusion doivent être oxydés. Les deux résidus de cystéine oxydés correspondants existent dans la sous-unité α de αe2 (le complexe utilisé pour l'auto-échange de sous-unités des L-NHases dans R. rhodochrous J1)9, ce qui suggère que les deux résidus de cystéine dans α(P14K)2 devraient être oxydés. Les métallochaperones sont des protéines liant les métaux conçues pour fournir l'ion métallique ou le cofacteur métallique approprié à leurs cibles hautement spécifiques3. L'ion métallique ou le cofacteur métallique est généralement transféré entre deux protéines différentes et le transfert dépend de la spécificité et de l'affinité du ligand pour l'ion métallique ou le cofacteur métallique, comme la métallochaperone de cuivre transférant les ions de cuivre à l'ATPase et à la superoxyde dismutase32,33,34,35 et les métallochaperones de nickel transférant les ions de nickel à l'uréase et à l'hydrogénase36,37,38. Au cours de ces processus, les métallochaperones de cuivre sont complètement différentes de l'ATPase et de la superoxyde dismutase et les métallochaperones de nickel sont complètement différentes de l'uréase et de l'hydrogénase, les protéines cibles devraient présenter une spécificité et une affinité de ligand plus élevées que les métallochaperones. Cependant, bien que α(P14K)2 et NHase soient deux protéines différentes, les sous-unités α dans α(P14K)2 et dans la fusion NHase ont la même séquence d'acides aminés et devraient avoir les mêmes ligands d'ions cobalt. Par conséquent, nous avons découvert un modèle de transfert d'ions métalliques pour la biosynthèse des métalloprotéines, dans lequel un ion métallique est transporté entre les mêmes sous-unités protéiques dans différents complexes protéiques.

Il est mystérieux que l'ion cobalt se transfère dans la même protéine avec le même environnement de ligand. Ce phénomène peut être lié à la structure du site actif de la NHase. Les Cys-SO2H et Cys-SOH oxydés après la traduction ont respectivement des structures Cys-SO2− et Cys-SO− déprotonées et les Cys-SO2− et Cys-SO− déprotonées dans la sous-unité α forment des ponts salins avec deux arginine de la sous-unité β de la NHase (Fig. S2)9. Seule la force électrostatique est nécessaire pour que le sel déclenche l'échange de sous-unités du soi9. Les ponts salins correspondants ne devraient pas exister dans α (P14K) 2 car P14K est plus courte que la sous-unité β, dépourvue de l'arginine correspondante (Fig. S3). Les ponts salins ont probablement influencé l'environnement du ligand de l'ion cobalt, ce qui a entraîné une plus grande affinité pour l'ion cobalt. Par conséquent, lorsque α(P14K)2 est mélangé avec les NHases de fusion, l'ion cobalt est transféré de la sous-unité α de α(P14K)2 au domaine de la sous-unité α des NHases de fusion. Le processus de transfert du cobalt est associé à l'oxydation de la cystéine en raison de la fonction d'oxydation de la cystéine du chaperon d'échange de sous-unités du soi9. Un tel processus est représenté sur la figure 6b.

Alors que l'apo-NHase-(BA)P14K était activée par α(P14K)2 jusqu'à 50% des NHases de fusion, l'apo-NHase-(BA) n'était activée que jusqu'à 30% d'activité (tableau 1). Ces résultats indiquent que la structure de l'apo-NHase-(BA)P14K pourrait être différente de celle de l'apo-NHase-(BA) et l'apo-NHase-(BA)P14K est plus adaptée à l'incorporation de cobalt par α(P14K)2. La différence entre l'apo-NHase-(BA) et l'apo-NHase-(BA)P14K réside dans la présence ou l'absence du gène P14K, ce qui indique que la protéine P14K affecte la structure de fusion NHase et nous pouvons supposer que P14K agit également probablement comme un chaperon moléculaire pour le repliement de la NHase.

Bien que l'ion cobalt ait été transféré de α (P14K) 2 dans les NHases de fusion in vitro (tableau 1), ce processus ne devrait pas exister in vivo car α (P14K) 2 ne peut pas être formé dans une cellule car les sous-unités β et α sont fusionnées en une seule protéine. Parce que P14K est nécessaire pour activer l'expression de la NHase de fusion et agit comme un chaperon moléculaire pour le repliement de la NHase, nous avons proposé un processus post-traductionnel pour la NHase-(BA)P14K in vivo. Comme le montre la figure 6c, après traduction des gènes BA et P14K, P14K entre en contact avec le domaine de la sous-unité α de la protéine de fusion βα et un ion cobalt est inséré dans le domaine de la sous-unité α avec l'aide de P14K. Le repliement des protéines se produit avec l'aide de P14K après l'incorporation de cobalt, entraînant la formation de NHase de fusion fonctionnelle. P14K se dissocie de la NHase de fusion au cours du processus post-traductionnel25. Dans ce processus, P14K agit probablement comme un chaperon moléculaire spécifique à l'apoprotéine3 pour l'incorporation du cobalt dans les NHases de fusion, telles que GroEL, Hsp70 et Hsp40, qui se lient et empêchent le mauvais repliement ou stimulent le repliement d'un large éventail de protéines39.

Étant donné que P14K est d'abord mis en contact avec le domaine de la sous-unité α de la protéine βα fusionnée pour l'incorporation de cobalt dans les NHases de fusion, la question se pose de savoir pourquoi ce processus ne pourrait pas se produire dans la NHase de type sauvage. P14K et d'autres chaperons d'échange d'auto-sous-unités présentent une similitude de séquence significative avec la sous-unité β NHase correspondante (homologie d'environ 30%) (Fig. S3) et les deux se connectent à la sous-unité α. La sous-unité β et P14K pourraient avoir les mêmes sites de liaison dans la sous-unité α. Une compétition pour la liaison de la sous-unité α se produit pendant le processus post-traductionnel de la NHase de type sauvage. En conséquence, l'apo-NHase et l'α (P14K) 2 sont formés, suivis d'un échange d'auto-sous-unités pour la biosynthèse de la NHase. Dans ce cas, P14K ne pouvait pas se lier au βα, car les sites de liaison de la sous-unité α sont occupés par la sous-unité β. Pour la NHase-(BA)P14K, la sous-unité β est fusionnée avec la sous-unité α et les sites de liaison de la sous-unité α deviennent libres. Par conséquent, P14K se lie directement aux sites de liaison de la sous-unité α de la fusion βα pour l'incorporation du cobalt.

Nous avons découvert que l'incorporation de cobalt dans la plupart des Co-NHases dépend de l'auto-échange de sous-unités in vitro et in vivo9,11, alors que l'ion cobalt dans la sous-unité α de α(P14K)2 est directement transféré dans le domaine de la sous-unité α des NHases de fusion au lieu de l'échange de sous-unités in vitro (tableau 1). Par conséquent, une autre question se pose de savoir pourquoi le transfert direct ne pourrait pas se produire lors de la biosynthèse de la NHase de type sauvage. Il est possible que les deux mécanismes se produisent dans le processus de biosynthèse de la NHase de type sauvage ; le mécanisme antérieur serait l'auto-échange de sous-unités. La liaison du cobalt avec la sous-unité α est plus étroite que la liaison du chaperon d'échange de sous-unité auto avec la sous-unité α, de sorte que l'échange de sous-unité α est plus facile que le transfert direct de cobalt. Par conséquent, bien que les deux mécanismes se produisent dans le processus de biosynthèse de la NHase de type sauvage, l'échange d'auto-sous-unités pourrait avoir lieu avant le transfert direct du cobalt. Le mécanisme de veille du transfert direct du cobalt peut avoir une fonction partielle pour l'incorporation du cobalt. En conséquence, l'apo-NHase-(BA)P14K et l'apo-NHase-(BAP14K) ne sont que partiellement activées par α(P14K)2 (tableau 1). De plus, le chaperon d'échange d'auto-sous-unité joue un rôle important dans l'incorporation d'ions cobalt dans la sous-unité α. Il a été rapporté que la flexibilité du domaine C terminal de P14K est l'un des facteurs clés de l'incorporation du cobalt dans la sous-unité α40 ; les NHases de fusion codées par les gènes BP14KA et P14KBA affecteraient la flexibilité du domaine C terminal de P14K car il existe une sous-unité α ou β située dans le domaine C terminal de P14K, ce qui réduit la flexibilité. Cela peut être l'une des raisons pour lesquelles les deux NHases de fusion ont présenté une activité plus faible.

La fusion de gènes force sensiblement une paire de protéines à interagir en permanence les unes avec les autres et l'événement de fusion tend à optimiser l'assemblage en simplifiant les topologies complexes de protéines23. Ici, grâce à une stratégie de fusion de gènes, nous avons construit deux NHases de fusion aux propriétés supérieures. Le mécanisme d'incorporation du cobalt a été modifié avec cette évolution moléculaire in vivo et nous avons découvert un modèle de transfert d'ions métalliques qui se produit entre les mêmes protéines in vitro, ce qui a révélé un comportement inattendu d'une métallochaperone. Le mécanisme d'incorporation du cobalt dans la NHase est fantastique et variable et les détails doivent être étudiés plus avant.

Le gène codant pour la NHase de type sauvage de P. putida ABP14K a été obtenu à partir de P. putida12. Les plasmides pET-24a (+) et pET-28a (+) ont été utilisés comme vecteurs et E. coli BL21 (DE3) a été utilisé pour la surexpression.

Les amorces oligonucléotidiques utilisées dans cette étude ont été présentées dans le tableau S1. Le plasmide pET24a-BAP14K a été utilisé comme matrice et les amorces B-Nde I-up et P-Hind III-down ont été conçues pour l'introduction des sites de restriction Nde I et Hind III, respectivement. Le fragment d'ADN amplifié a été purifié à l'aide d'un kit de purification PCR (Promega) et digéré par Nde I et Hind III, ligaturé dans les sites Nde I et Hind III de pET-28a (+), puis transformé dans E. coli JM109 et séquencé. Si la séquence était correcte, l'extrait de plasmide de E. coli JM109 a été transformé en E. coli BL21 (DE3). Les plasmides recombinants (pET28a-(BA)P14K et pET28a-(BAP14K)) ont été construits par un protocole PCR d'extension de chevauchement basé sur pET28a-BAP14K. Pour construire pET28a-(BA)P14K et pET28a-(BAP14K), des paires d'amorces Linker1-up et Linker1-down ont été utilisées pour connecter les sous-unités β et α et Linker2-up et Linker2-down ont été utilisées pour connecter les sous-unités α et P14K. Ensuite, pET28a-(BA) a été construit avec les paires d'amorces B-Nde I-up et A-Hind III-down amplifying (BA) de pET28a-(BA)P14K et le produit PCR et pET-28a (+) ont tous deux été digérés avec Nde I et Hind III après 4 heures. Le fragment d'ADN purifié a ensuite été ligaturé dans les sites Nde I et Hind III de pET-28a (+). Les plasmides recombinants (pET28a-(BP14KA) et pET28a-(P14KBA)) ont été respectivement construits par un protocole de PCR d'extension de chevauchement basé sur pET28a-(BA) avec le produit de PCR P14K-1 et P14K-2 comme amorces. Le produit PCR P14K-1 a été amplifié avec les paires d'amorces B(P)A-up et B(P)A-down et P14K-2 a été amplifié avec les paires d'amorces (P)BA-up et (P)BA-down avec pET24a-BAP14K comme matrice.

L'E.coli recombinant pour l'expression de l'enzyme a d'abord été cultivé dans 10 ml de milieu 2YT liquide contenant 50 μg/ml de kanamycine à 37°C, puis cultivé dans 500 ml de milieu 2YT liquide dans un flacon de 2 litres contenant 50 μg/ml de kanamycine à 37°C sous agitation à 200 rpm. Lorsque la densité optique à 600 nm (DO600) de la culture a atteint 0,8, de l'isopropyl β-D-1-thiogalactoside (IPTG) a été ajouté à une concentration finale de 0,4 mM pour induire l'expression de la NHase et du CoCl2.6H2O a été ajouté à une concentration finale de 0,05 g/l pour obtenir la NHase mature. La culture a ensuite été incubée à 24°C pendant 16h.

Toutes les étapes de purification ont été réalisées à 0–4 °C. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 6 000 × g pendant 15 min, remises en suspension dans 10 mM de KPB (contenant 0, 5 mM de dithiothréitol, pH 7, 4) et lysées par sonication sur glace. Les surnageants ont été éliminés par centrifugation à 15 000 xg pendant 15 min et filtrés à travers un filtre à pores de 0,22 µm. Pour la purification des protéines sans aucune étiquette, une colonne DEAE-Sephacel (3 × 5 ml) (GE Healthcare UK Ltd.) a été utilisée. Tout d'abord, la colonne a été équilibrée avec 10 mM de KPB et la protéine a été éluée avec un gradient linéaire de 0 à 0,5 M de KCl dans du KPB. Les fractions actives ont été recueillies, concentrées à 1 ml par ultrafiltration et appliquées sur une colonne SuperdexTM 200 10/300 GL (GE Healthcare UK Ltd.) et équilibrées avec 10 mM KPB, avec un débit de 0,5 ml/min. Pour la purification des enzymes marquées par His, le filtrat a été appliqué sur une colonne de chromatographie HisTrap HP (GE Healthcare) à l'aide d'un purificateur AKTA (GE Healthcare, Houston, TX). La colonne a été équilibrée avec le tampon A (tampon phosphate 50 mM, NaCl 0,3 M et imidazole 20 mM, pH 7,4) et les protéines liées ont été éluées avec le tampon B (tampon phosphate 50 mM, NaCl 0,3 M et imidazole 500 mM, pH 7,4). De même, pour la purification des enzymes marquées par Strep, une colonne StrepTrap HP (GE Healthcare UK Ltd.) a été équilibrée avec un tampon de liaison (20 mM Na2HPO4·12H2O, 280 mM NaCl, 6 mM KCl, pH 7,4). Après avoir injecté le surnageant sur la colonne et incubé pendant une demi-heure, nous avons élué les protéines avec un tampon d'élution (tampon de liaison contenant 25 mM de desthiobiotine, pH 7,4). Les fractions actives ont été recueillies et l'étape suivante de filtration sur gel était la même que celle mentionnée ci-dessus. Les protéines purifiées ont été analysées par électrophorèse sur gel de sodium dodécylsulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) et la concentration en protéines a été quantifiée par la méthode de Bradford41.

Pour déterminer les masses moléculaires et les structures des NHases, les enzymes purifiées et les protéines marqueurs ont été appliquées sur une colonne SuperdexTM 200 10/300 GL (GE Healthcare UK Ltd.). Les masses moléculaires ont été calculées à partir de la courbe standard des protéines marqueurs par extrapolation. Les structures des enzymes ont été spéculées à partir des masses moléculaires.

L'activité NHase a été mesurée par l'augmentation du produit. Le mélange réactionnel (0,5 ml) contenait 10 mM de KPB (pH 7,4), 200 mM de 3-cyanopyridine et 10 ul de la quantité appropriée de la solution enzymatique. La réaction a été effectuée à 25°C pendant 10 min et arrêtée avec l'ajout de 0,5 ml d'acétonitrile. La quantité de produit formé a été déterminée en mesurant l'absorbance à 215 nm et en extrapolant à partir d'une courbe standard. Une unité (U) d'activité NHase est définie comme la quantité d'enzyme qui a libéré 1 μmol de nicotinamide par minute dans ces conditions de test.

Les enzymes purifiées (0,5 mg/ml) ont été analysées avec un spectrophotomètre d'absorption atomique Shimadzu AA-7000 dans les conditions suivantes : longueur d'onde, 240,73 nm ; courant de la lampe, 12 mA ; et largeur de fente, 0,2 nm. La quantité d'ion cobalt dans les enzymes purifiées a été calculée par extrapolation à partir d'une courbe standard.

Les spectres UV-V ont été obtenus avec un spectrophotomètre U-3900 (Hitachi, Tokyo, Japon) à température ambiante. Les enzymes ont été dialysées contre du KPB 10 mM (pH 7,5) et des échantillons de 1,0 mg/ml ont été préparés.

Les paramètres cinétiques (Km, Vmax, kcat) de BAP14K et des protéines de fusion ont été déterminés dans du KPB 10 mM à 25 °C et la concentration des enzymes était de 0,2 mg/ml. Les concentrations de 3-cyanopyridine étaient de 10, 20, 50, 100 et 200 mM et la réaction a été terminée avec de l'acétonitrile après 2 minutes. Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du progiciel Graphpad Prism 5.

Pour déterminer la stabilité thermique, nous avons incubé les enzymes purifiées à 50°C pendant 40 minutes et mesuré leur activité toutes les dix minutes. La méthode de détermination de l'activité était telle que mentionnée ci-dessus.

La tolérance du produit a été représentée par la décrémentation de la 3-cyanopyridine en présence de 0,5 M de nicotinamide et sans que le nicotinamide ait été utilisé comme témoin. Pour comparer la tolérance au produit des recombinases, nous avons déterminé la réduction de la 3-cyanopyridine dans les mélanges avec et sans nicotinamide.

Le pH optimal pour l'activité enzymatique a été déterminé en effectuant le test dans des tampons de pH (KH2PO4, 3,893 g/l ; C6H8O7·H2O, 6,008 g/l ; H2BO3, 1,769 g/l ; et Barbital-Na2, 5,266) (pH 6,0 à 11,0). Le pH avec l'activité la plus élevée a été défini comme le pH optimal et l'activité la plus élevée a été prise comme 100 %.

Les spectres de dichroïsme circulaire (CD) ont été collectés à l'aide d'un MOS-450 / AF-CD-STP-A (Bio-Logic, Grenoble, France) avec une cuvette en quartz de 1 cm de longueur de trajet à une concentration en protéines de 0, 2 mg / ml dans 10 mM KPB. Le spectropolarimètre et la lampe au xénon ont été réchauffés pendant 30 minutes avant les expériences. Nous avons mesuré l'ellipticité entre 190 et 250 nm et le spectre d'un blanc tampon a été soustrait. Nous avons utilisé une méthode en ligne K2D3 sur un serveur Web accessible au public à http://k2d3.ogic.ca/ pour prédire les types de structure secondaire. Cette méthode améliore les prédictions, notamment pour l'intervalle de longueur d'onde entre 200 et 240 nm et pour la teneur en brins bêta42.

Dans une étude précédente, l'activateur P14K pouvait exister avec la sous-unité α sous la forme d'hétérotrimère α(P14K)2 et il pouvait exister de manière stable lorsqu'un Strep-tag était ajouté au N-terminal de P14K12. En conséquence, nous avons utilisé pET24a-StrepP14K pour préparer α(StrepP14K)2. L'apo-protéine a été cultivée en l'absence de cobalt. A l'inverse, la protéine contenant du cobalt a été cultivée en présence de cobalt. L'apo-NHase purifiée (0,1 mg/ml) a été mélangée avec l'α(StrepP14K)2 purifié contenant du cobalt (0,8 mg/ml), suivi d'une incubation dans du KPB 10 mM (contenant du dithiothréitol 0,5 mM, pH 7,4) à 25°C. Comme témoin, l'apo-NHase purifiée a été mélangée avec de l'ion cobalt (20 μM) de la même manière.

Un spectromètre de masse MALDI-TOF (ultrafleXtreme, Bruker Daltonics) a été utilisé pour déterminer la masse moléculaire de la sous-unité fusionnée. Les spectromètres de masse MALDI-TOF récemment introduits permettent l'acquisition de spectres d'ions fragments de haute qualité à partir de biomacromolécules par fragmentation induite par laser (LID). La matrice (7,6 mg de 2,5-dihydroxyacétophénone a été diluée dans 375 μl d'éthanol et ajouter 125 μl de solution de citrate de dihydrogène d'ammonium à 18 mg/ml) a d'abord été préparée et 2 μl de matrice, 2 μl de solution de TFA à 2 % et 2 μl d'échantillon (5 mg/ml) ont été mélangés. La solution d'échantillon a été entièrement mélangée à l'aide de pointes de pipette jusqu'à ce que la cristallisation puisse être observée. La solution d'échantillon de 0,5 μl a été déposée et séchée sur une plaque cible en acier inoxydable poli. La quantification des signaux de masse a été réalisée par le logiciel FlexAnalysis.

Le traitement des échantillons suit un protocole couramment utilisé43. En bref, la solution d'échantillon a d'abord été dénaturée dans de l'urée 8 M, avec des liaisons disulfure réduites par du dithiothréitol et tous les résidus de cystéine ont été carboxamidométhylés par de l'iodoacétamide. L'échantillon a ensuite été nettoyé par dialyse et digéré avec TPCK-trypsine (Promega) dans le tampon de digestion (bicarbonate d'ammonium 100 mM, pH 8,5). Les peptides issus de la digestion ont été complètement séchés dans un appareil SpeedVac (Thermo). L'échantillon séché a ensuite été redissous dans une solution d'échantillon (2 % d'acétonitrile, 0,5 % d'acide formique et 97,5 % d'eau). Un échantillon de peptide dissous a ensuite été analysé par un système NanoLC-ESI-MS/MS.

L'analyse NanoLC-ESI-MS/MS d'échantillons de protéines digérées a été réalisée par un système de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) (Agilent) avec une colonne C18 en phase inverse d'un diamètre intérieur de 75 micromètres et d'une longueur de 8 cm. Le temps d'injection était de 20 minutes. Le solvant HPLC A était composé de 97,5 % d'eau, 2 % d'acétonitrile et 0,5 % d'acide formique et le solvant B était composé de 9,5 % d'eau, 90 % d'acétonitrile et 0,5 % d'acide formique. Le temps de gradation était de 100 minutes de 2 % de solvant B à 90 % de solvant B, plus 20 minutes pour le chargement de l'échantillon et 20 minutes pour le lavage de la colonne. Le débit de la colonne était d'environ 800 nanolitres par minute après séparation. Le volume d'injection typique était de 3 μl. Le système HPLC a été couplé en ligne avec un spectromètre de masse LTQ (Thermo) de manière à ce qu'un échantillon élué de la colonne HPLC soit directement ionisé par un processus d'ionisation par électrospray (ESI) et entre dans le spectromètre de masse. La tension d'ionisation a été optimisée à chaque fois et normalement dans une plage de 1,2 kV à 1,8 kV.

Comment citer cet article : Xia, Y. et al. Construction d'une nitrile hydratase à fusion de sous-unités et découverte d'un schéma innovant de transfert d'ions métalliques. Sci. Rep. 6, 19183; doi : 10.1038/srep19183 (2016).

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Ce travail est soutenu financièrement par le Programme national de recherche et de développement en haute technologie de Chine (Programme 863, 2014AA021304), les Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (JUSRP51411B), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31300087) et la Fondation des sciences naturelles du Jiangsu (BK20130131, BK20130139), un projet financé par le développement du programme académique prioritaire du Jiangsu High er établissements d'enseignement, le projet 111 (n ° 111-2-06), le programme de développement de l'industrie du "Centre d'innovation collaborative pour la fermentation industrielle avancée" de la province du Jiangsu.

Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, 214122, Chine

Yuanyuan Xia, Wenjing Cui, Zhongmei Liu, Li Zhou, Youtian Cui et Zhemin Zhou

Institut de biochimie appliquée et École supérieure des sciences de la vie et de l'environnement, Université de Tsukuba, 1-1-1 Tennodai, Tsukuba, 305-8572, Ibaraki, Japon

Michihiko Kobayashi

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YX, WC, a effectué la purification des protéines. YX, WC, ZL, LZ et YC ont mené les investigations enzymatiques in vitro et in vivo. YX, WC, XZ et RS ont analysé les données et rédigé le manuscrit. MK et ZZ ont dirigé la recherche. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.

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Réimpressions et autorisations

Xia, Y., Cui, W., Liu, Z. et al. Construction d'une nitrile hydratase à fusion de sous-unités et découverte d'un schéma innovant de transfert d'ions métalliques. Sci Rep 6, 19183 (2016). https://doi.org/10.1038/srep19183

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Reçu : 14 mai 2015

Accepté : 07 décembre 2015

Publié: 12 janvier 2016

DOI : https://doi.org/10.1038/srep19183

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