Signalisation et extinction de la détection de quorum communautaire : assemblage de biofilm granulaire microbien

npj Biofilms and Microbiomes volume 1, Article number: 15006 (2015) Citer cet article

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Des rapports récents explorant le rôle des gradients de signaux de détection de quorum (QS) dans les boues activées fonctionnelles ont soulevé la question de savoir si les systèmes partagés de synthèse et de dégradation de signalisation, ou d'extinction de quorum (QQ), à travers la communauté informent des moyens par lesquels la biologie QS régule l'assemblage de biofilm floculaire et granulaire.

Dans cette étude, nous avons cherché à explorer l'origine des espèces et le rôle interactif des activités QS et QQ dans ces communautés de biofilms microbiens très diverses.

Ici, ces objectifs ont été abordés systématiquement par une approche expérimentale complète de séquençage d'ARN, de microbiologie et de chimie analytique, utilisant deux communautés de boues floculaires et granulaires apparentées mais ayant évolué indépendamment.

Nos données ont révélé une nette différence entre les potentiels QS et QQ des deux communautés, différentes espèces affichant en grande partie des fonctions QS ou QQ. La communauté de boues floconneuses a montré un taux élevé d'activité QQ, et ce taux dépendait de la longueur de la chaîne acyle démontrant la spécificité de la dégradation. Lorsque la biomasse floconneuse a été transformée en boue granulaire, l'activité QQ de la communauté a été réduite de 30 %. Les N-acyl homosérine lactones avec quatre à huit atomes de carbone sur la chaîne acyle se sont accumulées au stade granulaire et leurs concentrations étaient au moins trois fois plus élevées que celles du stade floconneux. Ces résultats ont corroboré l'analyse de la méta-communauté où un changement majeur dans les espèces dominantes des extincteurs de signal potentiels aux producteurs a été observé lors de la transition des flocs aux granulés, indiquant le rôle de la composition des espèces et des activités de signalisation associées dans la coordination des comportements communautaires.

Cette étude suggère que QQ a une fonction importante dans la régulation de la signalisation QS au niveau communautaire et fournit un aperçu mécaniste du rôle de la biologie QS dans l'assemblage communautaire complexe.

Dans la plupart des écosystèmes naturels et artificiels, les bactéries résident principalement dans des communautés structurées, dans des agrégations communément appelées biofilms microbiens.1 Ces consortiums microbiens peuvent être composés de centaines à des milliers d'espèces bactériennes avec des capacités métaboliques variables et affichant collectivement des propriétés au niveau de la communauté qui sont distinctes des cellules planctoniques.2,3 La composition et la fonction globales des biofilms complexes sont généralement déterminées par les interactions entre les différentes espèces microbiennes.1,3 afin de contrôler et de réguler les fonctions clés de l'écosystème. Celles-ci incluent, par exemple, l'ingénierie de communautés microbiennes hautement stables et durables pour le traitement de l'eau et des eaux usées, ou le traitement des maladies liées au biofilm.

Dans de nombreux cas, les interactions interespèces impliquent la communication via de petites molécules de signalisation diffusibles, un mécanisme généralement appelé détection du quorum (QS).3 De nombreuses bactéries utilisent le QS pour synchroniser les comportements de la population, y compris, mais sans s'y limiter, la formation de biofilm, la production d'exoenzymes et la sécrétion de facteurs de virulence, afin d'optimiser la croissance et la survie de la population dans différents environnements.4,5 10 % des protéobactéries isolées de diverses niches écologiques.6–8 En raison du fait que plusieurs membres de la communauté partagent les mêmes classes de molécules de signalisation, une diaphonie ou une communication entre des bactéries d'espèces différentes ou même entre des organismes de différents domaines est possible.9–12 de l'activité QS.10 Les AHL sont également présents à des concentrations biologiquement pertinentes dans des communautés complexes dans une gamme variée d'habitats, y compris les crachats de patients atteints de fibrose kystique,13 les tapis microbiens,14 le rumen 15 et les usines de traitement des eaux usées.16,17 Ces résultats suggèrent que la signalisation QS au niveau communautaire est susceptible d'être importante dans la plupart des habitats. En effet, le rôle du QS médié par AHL dans la formation de biofilms de boues complexes à espèces mixtes ainsi que dans l'assemblage de granules microbiens a été récemment démontré dans un bioréacteur à membrane18 et un réacteur discontinu de séquençage (SBR),19 respectivement. Pour le SBR, il a été constaté que la production in situ d'AHL spécifiques était fortement et positivement corrélée avec la morphogenèse des granules microbiens. Des concentrations élevées d'AHL étaient liées à la formation de granules, tandis que des concentrations réduites coïncidaient avec la désintégration des granules et la conversion en flocs. Plus important encore, ces processus étaient étroitement liés à l'abondance d'une gamme variée d'espèces microbiennes dans les communautés granulaires, suggérant une interaction communautaire très complexe basée sur l'AHL.

Un mécanisme possible pour la régulation du comportement QS dans l'environnement est via le contrôle des concentrations de signal, ce qui est essentiel pour une signalisation QS efficace. Il est possible que la concentration du signal dans l'environnement puisse être régulée via une activité de dégradation du signal enzymatique spécifique ou une extinction du quorum (QQ) par les membres de la communauté. Bien que QQ ait été démontré dans diverses espèces microbiennes,20–23 le rôle écologique et l'impact de QQ sur la signalisation QS restent largement inconnus. Ici, nous avons exploré le rôle de QQ en tant que régulateur ou modulateur de la signalisation QS communautaire. En utilisant une communauté complexe de boues floconneuses comme modèle, le QQ dépendant de l'AHL s'est avéré être actif et spécifique, médié par des membres de la communauté d'origines diverses. L'assemblage de la biomasse floconneuse dans les biofilms de boues granulaires était inversement corrélé aux activités QS et QQ concurrentes de la communauté, suggérant une fonction importante de QQ dans la coordination de la signalisation et du comportement QS au niveau de la communauté.

Un SBR (10 × 76,4 cm, diamètre × hauteur), ensemencé avec une communauté de boues floconneuses provenant d'une usine de récupération d'eau (Ulu Pandan, Singapour), a été opéré à 22 °C pendant 82 semaines. et des oligo-éléments.25 Le bioréacteur avait un volume de travail final de 4 l. Le fonctionnement du bioréacteur impliquait un cycle de 5 h avec deux étapes continues de périodes anaérobie, aérobie et anoxique. Un volume total de 1 litre SWW a été alimenté par cycle et a entraîné un temps de rétention hydraulique de 20 h. Le pH du bioréacteur a été maintenu entre 6,7 et 8,2 sous le contrôle d'un automate programmable via le dosage de 9,12 g/l de HCl ou de 10,0 g/l de NaOH. Les performances du système du bioréacteur ont été surveillées via des études de cycle hebdomadaires. Les concentrations d'ammonium, de nitrite, de nitrate et d'orthophosphate, ainsi que les concentrations de la biomasse des boues, c'est-à-dire les solides en suspension dans la liqueur mixte et les solides en suspension volatils dans la liqueur mixte, ont été déterminées conformément aux méthodes d'ingénierie standard de l'American Public Health Association (APHA).26 Des aliquotes d'un millilitre d'échantillons de boue ont été prélevées à la fin de la période anoxique. La biomasse des boues a été immédiatement récoltée après centrifugation (5 min, 8 000 g, 4 ° C) et stockée à -80 ° C pour une analyse ultérieure de l'ARN. De même, des aliquotes de 50 ml d'effluents traités ont été conservées à -80 ° C immédiatement après l'échantillonnage pour une analyse ultérieure de l'AHL. Aux semaines 40 à 44, une partie de la culture de boue floculante du SBR a été collectée et utilisée pour ensemencer un deuxième SBR (6 × 200 cm, diamètre × hauteur). Le deuxième SBR a fonctionné selon le premier SBR, avec quelques modifications, pour faciliter la formation de granulés microbiens (comme décrit précédemment en détail).19 En bref, le deuxième SBR a fonctionné à un temps de rétention hydraulique de 12 h et le temps de décantation pour chaque cycle a été réduit de 60 à 5 min au cours des 5 premières semaines de fonctionnement du réacteur. 5, une mesure de la densité/compacité de la biomasse) de 50 ml/g ou moins,19,27 tandis que les flocs étaient de la biomasse agrégée de manière lâche avec un diamètre de particule de 100 μm ou moins et un SVI5 d'au moins 50 ml/g.

Les biocapteurs AHL comprenant Agrobacterium tumefaciens A136,28 Chromobacterium violaceum CV026 (réf. 29) et Escherichia coli pJBA357,30 ainsi que P. aeruginosa MH602 (réf. 31) et E. coli JM109 (réf. 32) ont été maintenus en routine dans le milieu Luria-Bertani. Les antibiotiques suivants ont été ajoutés au milieu de croissance chaque fois que nécessaire : tétracycline (4,5 μg/ml), spectinomycine (50 μg/ml), kanamycine (50 μg/ml), ampicilline (100 μg/ml) ou gentamycine (40 μg/ml). Les génotypes de ces souches bactériennes sont répertoriés dans le tableau supplémentaire S1. Les cultures ont été incubées à 30 °C pendant 24 à 48 h.

Les AHL synthétiques (> 97 %) ont été achetées chez Sigma-Aldrich (Singapour). Chaque AHL était exprimée par un acronyme : C4-HSL (N-butyryl-DL-homosérine lactone), C6-HSL (N-hexanoyl-DL-homosérine lactone), 3OC6-HSL (N-(3-oxohexanoyl)-DL-homosérine lactone), C7-HSL (N-heptanoyl-DL-homosérine lactone), C8-HSL (N-octanoyl-DL-homosérine lactone), 3 OC8-HSL (N-(3-oxooctanoyl)-l-homosérine lactone), C10-HSL (N-décanoyl-DL-homosérine lactone), 3OC10-HSL (N-(3-oxodécanoyl)-L-homosérine lactone), C12-HSL (N-dodécanoyl-DL-homosérine lactone), 3OC12-HSL (N-(3-oxododécanoyl)-L -homosérine lactone), 3OHC12-HSL (N-(3-hydroxydodécanoyl)-DL-homosérine lactone), C14-HSL (N-tétradécanoyl-DL-homosérine lactone) et 3OC14-HSL (N-(3-oxotétradécanoyl)-L-homosérine lactone).

Des AHL synthétiques dissous dans du diméthylsulfoxyde (Sigma-Aldrich) ont été ajoutés individuellement ou en combinaison avec les microcosmes de culture de boues (récoltés du bioréacteur) à 5 μM pour chaque AHL, et incubés à 22 ° C avec agitation constante (200 tr/min). Des échantillons ont été prélevés dans chaque microcosme à différents moments et la biomasse des boues a été éliminée par centrifugation (10 min, 8 000 g). Les AHL résiduels dans le surnageant des boues ont été extraits et quantifiés par chromatographie liquide à haute performance et spectromètre de masse en tandem (Shimadzu, Singapour) comme décrit ci-dessous. Les boues inactivées par la chaleur et les témoins SWW ont été inclus. L'adsorption des AHL sur la biomasse des boues a été déterminée en comparant les AHL résiduels dans le SWW et les témoins de boues inactivées par la chaleur, immédiatement après l'ajout, ainsi qu'après 1 h d'incubation. Le pH de chaque microcosme de boue (liquide en vrac) a été surveillé tout au long de l'étude et variait entre 6,7 et 6,9. L'impact du pH sur l'intégrité des AHL a également été évalué en ajoutant des AHL synthétiques au SWW tamponné à différentes valeurs de pH allant de 6,7 à 8,3. Les courbes de régression linéaire et non linéaire ont été modélisées à l'aide de Prism (GraphPad, San Diego, CA, USA). La demi-vie du signal a été estimée sur la base d'une cinétique d'ordre zéro et de premier ordre.33

La détection et la quantification des AHL à partir des effluents traités au bioréacteur ou des surnageants de boues ont été réalisées comme décrit par Tan et al.19 En bref, les AHL ont été extraites et concentrées des surnageants à l'aide de dichlorométhane (Sigma-Aldrich). Les extraits de dichlorométhane ont été analysés et quantifiés à l'aide d'un système de chromatographie liquide à haute performance et de spectromètre de masse en tandem (Shimadzu LCMS8030, Shimadzu). Tous les échantillons ont été chromatographiés par chromatographie liquide à haute performance (colonne Shim-pack XR-ODS C18) à un débit de 0,3 ml/min. La phase mobile consistait en un gradient linéaire (40 à 95 %) de solvant B (méthanol avec 0,1 % d'acide formique) et de solvant A (25 mM de formiate d'ammonium avec 0,1 % d'acide formique). Les effluents ont été ionisés par ionisation par électrospray en mode positif et détectés à l'aide de l'approche de surveillance de réactions multiples.14,34 Des expériences de surveillance de réactions multiples appariées à la matrice ont été menées pour tous les AHL.19 Chaque profil standard de surveillance de réactions multiples, y compris le temps de rétention spécifique de la chromatographie liquide (LC), l'apparition de l'ion précurseur m/z et de deux ions de transition, ainsi que l'intensité relative des deux ions de transition, a été utilisé comme référence. Pour confirmer l'identité des AHL putatifs, un balayage complet allant de m/z 100 à 350, couplé au mode de balayage des ions précurseurs, a été réalisé en comparaison avec les AHL standard.14 Pour la quantification des AHL, des courbes standard appariées à la matrice, allant de 0,5 à 200 μg/l, ont été construites. Deux ions de transition, caractéristiques des AHL respectifs, ont été utilisés pour identifier l'AHL, et l'ion de transition avec l'intensité la plus élevée a été utilisé pour construire les courbes standard. Les zones de pic d'analyte ont été intégrées à l'aide de LabSolutions (Shimadzu). Les limites de détection et de quantification pour chaque AHL ont été calculées avec un rapport signal sur bruit de 3,3 et 10, respectivement.14 La quantité de chaque AHL putatif dans l'échantillon a été calculée sur la base de la courbe standard et de l'efficacité d'extraction de l'AHL respectif. L'efficacité d'extraction pour chaque AHL a été calculée sur la base de la récupération des AHL standard ajoutés à 5 et 50 μg/l à la matrice d'échantillon de surnageant de boue inactivée par la chaleur. Des injections à blanc ont été effectuées aux intervalles d'injections d'échantillons pour éviter le report d'échantillons.

Un total de cinq expériences d'isolement indépendantes ont été réalisées à partir des semaines 40 à 44 du fonctionnement du bioréacteur. A chaque fois, 20 ml d'échantillons de boue uniformément mélangés ont été prélevés du bioréacteur à la fin d'un cycle de fonctionnement. Les échantillons de boue ont été vortexés vigoureusement pendant 5 min pour disperser les cellules floculaires, dilués en série et étalés sur les milieux de culture suivants : bouillon nutritif, R2A, isolement de Pseudomonas, SWW et ABT35 additionnés de 1,5 % (p/v) d'agar chacun. Les plaques ont été incubées à 22°C pendant 5 jours. Un total de 330 souches avec des morphologies de colonies distinctes ont été isolées et identifiées par séquençage du gène de l'ADN ribosomique (ADNr).

Les amorces universelles 27F (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′) et 1492R (5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′) ciblant le gène ADNr 16S ont été utilisées pour séquencer les bactéries,36 tandis que les amorces ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) et ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3 ') ont été utilisés pour séquencer la région d'espacement interne transcrite afin d'identifier les champignons.37 Le séquençage a été effectué à l'aide du Big Dye Terminator (Applied Biosystems, Singapour). Les séquences ont été assemblées à l'aide de l'assembleur de séquences DNA Baser v3.5.2 (Heracle Biosoft, www.DnaBaser.com) et appariées à l'aide d'outils de recherche de similarité de séquence en ligne, tels que BLAST, Greengenes et SILVA. Les séquences d'isolat obtenues dans cette étude sont disponibles via GenBank sous les numéros d'accession KC252636–KC252965.

Pour le test biologique A. tumefaciens A136, une gélose indicateur ABT35 avec 50 μg/ml de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-bD-galactopyranoside (X-gal) a été préparée, tandis que la gélose Luria-Bertani a été utilisée pour le test biologique C. violaceum CV026. Dix microlitres de cultures d'une nuit de biocapteurs ont été déposés sur les plaques indicatrices, tandis que 10 μl de cultures d'isolats d'une nuit ont été placés à 5 mm de la tache du biocapteur et incubés à 30 ° C pendant 48 h. Les AHL produites in situ ont été détectées à l'aide du biocapteur E. coli JBA357. En bref, 100 μl de culture d'E. coli JBA357 diluée 5x ont été ajoutés à 100 μl d'échantillons dans une plaque à 96 puits et incubés à 22 ° C sous agitation constante à 200 tr / min pendant 4 h avant examen au microscope confocal à balayage laser (Zeiss LSM 710, Carl Zeiss Pte. Ltd., Singapour) à une longueur d'onde d'excitation / émission de 488/52 2–535 nm. E. coli JM109, P. aeruginosa MH602 et des AHL synthétiques ont été inclus comme témoins.

Des AHL (3OC6-HSL, 3OC8-HSL et 3OC12-HSL) ont été ajoutées individuellement aux cultures d'une nuit d'isolats à 5 μM et incubées à 22 ° C sous agitation constante à 200 tr / min pendant 2 h. Après centrifugation et stérilisation aux ultraviolets, les AHL résiduels ont été quantifiés à l'aide du test biologique A. tumefaciens A136. Cinq microlitres d'échantillons ont été déposés à une extrémité des barres de gélose. Environ 0,5 μl de culture d'une nuit de A. tumefaciens A136 a été repéré à des distances progressivement plus éloignées des échantillons chargés. Les plaques ont été incubées à 30°C pendant 24h. Des AHL ajoutées à Luria-Bertani à pH 6,7, 7,2 et 10,2, et des cultures d'E. coli JM109 ont été incluses comme témoins. Le pH de toutes les cultures d'une nuit a été déterminé comme étant <7,3 à la fin des expériences.

Les séquences d'ADNr 16S ont été alignées par le package d'alignement multiple ClustalW (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) et une région consensus couvrant toutes les séquences a été sélectionnée pour une analyse plus approfondie. Les séquences alignées ont été soumises à la construction d'arbres phylogénétiques en utilisant la méthode de jonction de voisins40 fournie par le MEGA4 (http://www.megasoftware.net/mega4/mega.html). Des analyses bootstrap du maximum de vraisemblance ont été effectuées avec 1 000 répétitions.

L'ARN total a été extrait des boues à l'aide du kit FastRNA Pro Soil-Direct (MP Biomedicals, Singapour) conformément aux directives du fabricant. L'ARN extrait a été soumis à une élimination de l'ADN à l'aide du kit TURBO DNA-free (Applied Biosystems). L'ARN total, 200 ng, a été utilisé pour la préparation de la bibliothèque d'ADN complémentaire selon les instructions du fabricant (Illumina, Singapour). Chaque bibliothèque d'ADN complémentaire a été ligaturée avec une séquence adaptatrice unique pour le multiplexage des échantillons. Un total de 16 bibliothèques d'ADN complémentaires différentes ont été regroupées et séquencées par MiSeq System (Illumina). Les données de séquençage de l'ARN ont été analysées à l'aide d'une méthode basée sur une étiquette rapide telle que décrite.19 En bref, une amorce universelle (5′-CGACRRCCATGCANCACCT-3′) pour la région hypervariable de l'ARNr 16S (V6) a été utilisée pour scanner chaque lecture de séquençage afin d'obtenir les 33 séquences d'étiquettes nucléotidiques en aval de l'amorce, et les 33 séquences nucléotidiques sont définies comme l'étiquette V6 du gène de l'ARNr 16S. L'amorce universelle correspond à 94 % des séquences d'ARNr 16S dans la base de données RDP.41 Pour éliminer les étiquettes V6 dérivées d'erreurs de séquençage, seules les étiquettes V6 qui ont été observées dans au moins deux lectures différentes ont été conservées pour analyse. De plus, les balises V6 ont été supprimées lorsqu'un seul type de lecture de séquençage représentait ⩾50 % de toutes les lectures couvrant cette balise V6. Cela a été fait pour éliminer les artefacts de séquençage où des lectures dupliquées identiques ont été générées à partir de modèles uniques.

Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de Prism (GraphPad) ou R (www.r-project.org). Les tests de comparaisons multiples de Holm-Sidak ont été effectués pour comparer les demi-vies des AHL dans différents échantillons ou pour examiner l'expression des AHL entre différents échantillons de boues. Les coefficients de corrélation de Pearson ont été déterminés et des corrections du taux de fausses découvertes ont été apportées pour toutes les corrélations multiples. Les matrices de corrélation ont été regroupées à l'aide d'une méthode de regroupement hiérarchique non supervisée basée sur la distance euclidienne avec une liaison complète codée par le cluster 3.0 et visualisée à l'aide de Java TreeView (Open Source Clustering Software, Tokyo, Japon).

Un bioréacteur à communauté de boues floculaires très diversifié subissant simultanément une nitrification, une dénitrification et une élimination du phosphore a été utilisé comme système expérimental (Figure supplémentaire S1). Pour déterminer si l'activité QQ spécifique à l'AHL était présente dans ce système modèle, des AHL synthétiques ont été ajoutées individuellement ou sous forme de mélange à la boue floculaire pour caractériser les taux de dégradation du signal. Environ 10 à 30 % des AHL ont été perdues en raison de l'adsorption sur la biomasse, tandis que la perte des 70 à 90 % restants du signal a été attribuée à l'activité biologique (Figure supplémentaire S2). Cela était évident par les demi-vies d'AHL sensiblement plus courtes en présence de boues vivantes que lorsqu'elles étaient incubées en présence de boues inactivées par la chaleur (P <0, 05 pour tous les AHL; Figure 1). En présence de boues vivantes, la demi-vie du signal était inversement proportionnelle à la longueur de la chaîne acyle, quelle que soit la substitution en position C3 (Figure 1). Par exemple, les demi-vies des signaux à chaîne courte C6-HSL et 3OC6-HSL étaient respectivement de 1, 95 ± 0, 45 et 2, 57 ± 0, 29 h, tandis que les demi-vies des signaux à longue chaîne C12-HSL et 3OC12-HSL étaient considérablement plus courtes à 0, 79 ± 0, 08 et 0, 66 ± 0, 06 h, respectivement. Le pH du microcosme de boues vivantes était constant entre 6,7 et 6,9, et les données des témoins tamponnés SWW indiquaient qu'il y avait peu de dégradation spontanée des AHL entre des valeurs de pH de 6,7 à 8,3 (Figure supplémentaire S3). Par conséquent, il est probable que la perte d'AHL observée ici soit due à une digestion enzymatique active plutôt qu'à une dégradation chimique passive.

Dégradation des N-acyl homosérine lactones (AHL) basée sur la fonction de la longueur de la chaîne acyle dans les boues floconneuses. La valeur de dégradation est exprimée comme la demi-vie du signal. Un mélange d'AHL non substituées (a) et oxo-substituées (b) a été ajouté à la boue vivante (cercle ouvert) ou à la boue inactivée par la chaleur (cercle plein) à une concentration finale de 5 μM pour chaque AHL. Le mélange de boues a été incubé à température ambiante avec une agitation constante à 200 tr/min. Le pH de chaque mélange de boues (liquide en vrac) a été surveillé tout au long de l'étude et variait entre pH 6,7 et 6,9. Les AHL résiduels ont été extraits et quantifiés par LC-MS/MS à différents moments. La demi-vie du signal pour chaque AHL a été estimée sur la base de la cinétique d'ordre zéro ou de premier ordre. Les barres d'erreur sont définies comme sem (n = 3, répétitions biologiques). Des tests t multiples de Holm – Sidak ont été effectués (témoins vivants ou inactivés par la chaleur pour chaque AHL) et les valeurs P corrigées (P <0, 05 pour toutes les paires de comparaison) sont rapportées.

Pour mieux comprendre les relations entre la spécificité de l'activité QQ et la production de signaux dans la communauté des boues floconneuses, 307 souches de bactéries et 23 souches de champignons, correspondant à 50 genres bactériens et quatre genres fongiques, ont été isolées et testées pour leur capacité à produire ou dégrader les AHL (tableau supplémentaire S2). Les isolats bactériens représentaient 3,5 % du nombre total de membres de la communauté identifiés par séquençage d'ARN (tableaux supplémentaires S3 et 4). La production d'AHL a été principalement évaluée sur la base de l'activation de différents biocapteurs, y compris E. coli JBA357,30 A. tumefaciens A13628 et C. violaceum CV026.29 Le profil AHL de chaque producteur de signal putatif a ensuite été déterminé par LC-MS/MS. La dégradation de l'AHL a été dosée à l'aide d'AHL avec des chaînes acyles courtes (3OC6-HSL), moyennes (3OC8-HSL) et longues (3OC12-HSL). Une grande proportion des isolats de boues floconneuses, 65 %, étaient soit des producteurs de signaux AHL, soit des extincteurs (Figure 2). Bien que seulement ~ 10 % des isolats aient pu produire des AHL, jusqu'à 58,1 % des isolats ont pu éteindre au moins un des AHL examinés. Une proportion relativement faible des isolats, 4,8 %, ont à la fois produit et désactivé des AHL. Les 36,7 % d'isolats restants n'ont ni produit ni éteint d'AHL. Tous les extincteurs AHL étaient capables d'inactiver l'AHL à longue chaîne, 3OC12-HSL. Bien que 77 % des extincteurs ne puissent dégrader que les AHL à longue chaîne, environ 23 % pourraient dégrader les AHL à longue chaîne ainsi que les AHL à chaîne courte ou moyenne.

Répartition des isolats en fonction de leur capacité à produire et/ou à désactiver les N-acyl homosérine lactones (AHL). Un total de 330 isolats, dont 307 et 23 souches d'origine bactérienne et fongique, respectivement, ont été cultivés à partir de la communauté de boues floculaires pendant le fonctionnement du bioréacteur des semaines 40 à 44. Tous les isolats ont été criblés pour la production d'AHL par différents bioessais et LC-MS/MS, ainsi que pour leur capacité à éteindre 5 μM d'AHL avec des chaînes acyles courtes (3OC6-HSL), moyennes (3OC8-HSL) et longues (3OC12-HSL) après 2 h d'incubation. Les AHL résiduels ont été quantifiés à l'aide du test biologique ponctuel à base de gélose A. tumefaciens A136.

Les relations évolutives entre les isolats bactériens, basées sur leurs séquences d'ADNr 16S, ont indiqué qu'il n'y avait pas de clade spécifique associé à l'activité QQ, tandis que les producteurs d'AHL étaient tous classés comme protéobactéries alpha, bêta ou gamma (Figure 3). Ces isolats QS représentaient des genres qui ont été précédemment signalés comme étant des producteurs d'AHL, tels que Acidovorax, Pantoea, Rhizobium, Rhodobacter, Sphingomonas et Stenotrophomonas, ainsi que de nouveaux genres qui n'ont pas été signalés comme synthétisant des AHL, notamment Frateuria, Lysobacter et Shinella (Figure 3). L'analyse LC-MS / MS a en outre révélé que les isolats produisaient des AHL de différentes longueurs de chaîne acyle allant de 4 à 14 carbones (tableau supplémentaire S5). Chaque isolat produisant un signal a synthétisé plus d'un type d'AHL et plusieurs genres/espèces pourraient produire le même AHL (tableaux supplémentaires S2 et 5). Par exemple, des isolats de six genres bactériens sur neuf étaient capables de synthétiser 3OC8-HSL (tableau supplémentaire S5), le signal dominant détecté dans la communauté des boues in situ (figure supplémentaire S4). En revanche, les extincteurs AHL ont été classés en quatre phylums bactériens différents, notamment les protéobactéries, les actinobactéries, les bactériodetes et les firmicutes, ainsi que des représentants des champignons (figure 3 et tableau supplémentaire S2). Bien que certains des isolats QQ représentaient des genres qui sont couramment signalés comme dégradant les AHL, tels que Ochrobacterium, Variovorax, Bacillus et Rhodoccus, la plupart des isolats QQ identifiés ici n'ont pas été démontrés auparavant comme ayant cette activité. Ces nouveaux organismes QQ ont été distribués dans les genres Novosphingobium, Acidovorax, Rheinheimera, Tsukamurella, Flavobacterium et Candida, entre autres. Fait intéressant, certains des isolats étaient capables à la fois de synthétiser et de dégrader les AHL, par exemple Rhizobium borbori N065. De plus, il y avait une variation considérable dans la fonction même au niveau de l'espèce. Par exemple, 10 souches de Stenotrophomonas sp. avec des séquences d'ADNr 16S identiques étaient capables de produire des AHL, alors que les six souches restantes ne l'étaient pas (tableau supplémentaire S2). De même, toutes les souches de la même espèce n'étaient pas capables d'éteindre les AHL, comme ce fut le cas pour Stenotrophomonas maltophilia. Les caractéristiques QS et QQ spécifiques de chaque isolat impliquent que la signalisation AHL au niveau de la communauté est complexe, et que la composition variable des espèces QS et QQ peut avoir des impacts différents sur divers comportements communautaires régulés par la signalisation.

Relation évolutive de 100 isolats bactériens représentatifs (taxons) basés sur les séquences du gène ADNr 16S. Chaque représentant a été sélectionné pour son caractère unique en termes de production de N-acyl homosérine lactone (AHL) et/ou de propriétés d'extinction. La relation évolutive a été déduite à l'aide de la méthode de jonction des voisins. L'arbre consensus bootstrap déduit à partir de 1 000 répliques a été pris pour représenter la relation évolutive des taxons analysés. Les branches correspondant aux partitions reproduites dans <50 % des réplicats bootstrap ont été réduites. L'arbre a été dessiné à l'échelle, la longueur des branches reflétant les distances évolutives. Les distances évolutives ont été calculées à l'aide de la méthode du maximum de vraisemblance composite et sont exprimées en unités du nombre de substitutions de base par site. Toutes les positions contenant des lacunes et des données manquantes ont été éliminées de l'ensemble de données (option de suppression complète). Il y avait un total de 1 031 postes dans l'ensemble de données final. Des analyses phylogénétiques ont été menées dans MEGA4. Les exogroupes, extraits de la base de données GenBank, sont soulignés. Les souches isolées sont classées comme productrice (triangle vert), quencher (carré bleu), productrice et quencher (losange rouge) et ni productrice ni quencher (cercle ouvert). Les genres dans lesquels des activités de production d'AHL (@) ou de dégradation d'AHL (*) ont été rapportées dans la littérature sont indiqués. Le parent le plus proche avec au moins 97 % d'identité de séquence pour chaque souche, à l'exception des souches mises en évidence en gras, est indiqué.

Pour explorer le rôle de la composition et de la signalisation des espèces sur la fonction de la communauté, en termes de structure du biofilm, les propriétés de signalisation de deux communautés indépendantes, à savoir les communautés de boues floculaires et granulaires19 ont été comparées. Les bioréacteurs à boues floconneuses et granulaires ont d'abord été ensemencés avec l'inoculum de boues floconneuses simultanées de nitrification, de dénitrification et d'élimination du phosphore,24 et ont été soit exploités pour maintenir les boues floconneuses, soit les conditions ont été modifiées pour faciliter la formation de granules microbiens.19 La composition des espèces et le profil de signal des deux communautés ont été caractérisés au fil du temps. L'analyse de corrélation de Pearson des 50 membres les plus abondants de la communauté des boues floculaires (y compris les membres non cultivables par séquençage d'ARN) et la concentration d'AHL individuels in situ ont révélé la dominance des membres de la communauté qui étaient négativement corrélés à la production d'AHL sur 82 semaines (Figure 4, panneau de gauche, Groupe 3). Environ 72 % des relations de Pearson ont été classées comme négatives, alors que seulement 20 % étaient positives au stade flocculaire (Figure 4, panneau de gauche). Le pourcentage élevé de relations négatives était cohérent avec les proportions plus élevées d'isolats QQ dans la communauté des boues floconneuses (figures 2 et 3). Lorsque les flocs ont été transformés en granulés, il y a eu une diminution significative de la corrélation négative entre les membres de la communauté et la concentration d'AHL, de 72 à 38 %, concomitante à une augmentation de 20 à 54 % des relations positives (Figure 4, panneau de droite).19 Ces résultats indiquent donc un changement distinct de la communauté des extincteurs de signal potentiels aux producteurs lors de la transition des flocs aux granulés. En conséquence, l'activité QQ des boues granulaires a été considérablement réduite par rapport aux boues floconneuses (Figure supplémentaire S5). Par exemple, la demi-vie du 3OC8-HSL était d'environ 28 % plus longue pour les boues granulaires par rapport aux boues floconneuses. De plus, les AHL, y compris 3OC6-HSL, 3OC8-HSL, C6-HSL et C8-HSL, se sont accumulées à une concentration au moins trois fois supérieure au stade granulaire par rapport au stade floconneux (P <0,05 pour tous les AHL) (Figure supplémentaire S6). En particulier, le signal dominant 3OC8-HSL est passé d'une moyenne de 25 pmol/g au stade floconneux à 85 pmol/g au stade granulaire (P<0,016). La quantité élevée d'AHL était auparavant associée à l'expression accrue de substances polymères extracellulaires et à la formation de granules microbiens, tandis que la diminution des niveaux d'AHL était liée à la dispersion granulaire et à la conversion en biomasse floconneuse. Ici, il semble que les gradients de signal pourraient être régulés par l'activité QQ de la communauté en fonction de la composition des espèces et de la capacité QQ associée. Il est donc possible que l'équilibre entre les activités QS et QQ concurrentes puisse déterminer le comportement ou la fonction de signalisation de la communauté, par exemple, l'assemblage de biofilms granulaires microbiens.19

Une comparaison entre les propriétés de signalisation des communautés de boues floconneuses (panneau de gauche) et granulaires (panneau de droite). Les relations entre l'abondance des 50 membres les plus dominants de la communauté (chacun représenté par une étiquette V6 unique) et le profil de concentration des N-acyl homosérine lactones (AHL) au fil du temps ont été calculées sur la base de la corrélation de Pearson pour les communautés de boues floculaires et granulaires respectives. Le coefficient de corrélation de Pearson est codé par couleur, indiquant les relations entre les interactions fortement positives (+1, vert) et fortement négatives (−1, rouge). ▲ Non classé sur la base du pipeline de classification taxonomique indiqué dans la section Matériels et méthodes. Le parent le plus proche avec une correspondance d'identité de séquence> 97% est indiqué là où il est applicable. Des corrections du taux de fausses découvertes pour les comparaisons multiples ont été effectuées et les différences significatives sont indiquées comme suit : *P<0,05, **P<0,01 et ***P<0,001. Les propriétés de signalisation de la communauté des boues granulaires ont été adaptées de Tan et al.19

L'étude des interactions interspécifiques est importante pour développer une compréhension systématique de la physiologie des communautés microbiennes à haute densité et enfermées dans une matrice, qui sont maintenant largement appréciées comme étant le mode de croissance dominant pour les bactéries dans les écosystèmes naturels et artificiels. ces résultats ont démontré les rôles du QS dans les communautés complexes, la question de la médiation des activités concurrentes, telles que la modulation QQ du QS dans les communautés complexes, reste à résoudre. En utilisant l'assemblage granulaire microbien comme modèle de comportement communautaire médié par le QS, cette étude a montré que le QQ supprime fortement l'accumulation du signal QS dans les boues floconneuses (Figure 1) et peut ainsi inhiber la formation de granules microbiens. Lorsque la suppression de QQ a été partiellement soulagée, indiquée par l'augmentation des demi-vies du signal au stade granulaire (Figure supplémentaire S5), les concentrations de signal ont été augmentées de manière significative (Figure supplémentaire S6), ce qui suggère que QQ peut être un modulateur efficace de la signalisation QS communautaire. En effet, l'ajout d'enzymes QQ exogènes à un bioréacteur à membrane peut retarder le développement de biofilms d'espèces mixtes sur les surfaces membranaires.18,43 Dans notre étude, nous avons en outre établi que QQ est une fonction inhérente à des communautés complexes qui peuvent avoir une forte influence sur de nombreuses interactions interspécifiques basées sur la signalisation AHL. Par conséquent, contrairement à certains habitats naturels où les facteurs environnementaux jouent un rôle dominant dans la régulation des niveaux de signaux QS, tels que les cycles de pH élevés induits par la photosynthèse (jusqu'à 9,4), qui atténuent fortement la signalisation AHL dans les tapis microbiens,14 nous avons constaté que le pH (jusqu'à <8,3) et l'adsorption physique du signal étaient moins importants que l'activité enzymatique dans l'inactivation des signaux dans notre système modèle (Figures supplémentaires S2 et 3). Cela suggère donc que l'activité QQ était le principal mécanisme d'élimination du signal et sert donc de régulateur clé des niveaux de signal à différentes étapes du cycle de vie de la granulation.

Sur la base des résultats obtenus dans cette étude, nous soutenons que l'accumulation globale d'AHL dans le système de granulation était directement liée aux proportions relatives et aux activités des organismes QQ et QS dans la communauté. Jusqu'à 60 % des isolats de la communauté des boues floculaires, représentant 32 genres bactériens et 4 genres fongiques, étaient des extincteurs de signal, tandis que seulement 10 % des isolats (9 genres bactériens) produisaient des AHL (figures 2 et 3). Alors que la proportion de producteurs d'AHL isolés observés ici est cohérente avec les observations d'autres environnements,7,8 la fréquence des extincteurs d'AHL est considérablement plus élevée que celle rapportée dans d'autres études (~ 5 à 15 % des isolats).7,8 La proportion plus élevée d'extincteurs d'AHL détectés ici est probablement une conséquence du test de l'activité QQ en utilisant une gamme d'AHL comme cibles, y compris les AHL à longue chaîne, qui n'ont généralement pas été utilisées pour détecter l'activité QQ. Fait intéressant, les AHL ont été dégradés d'une manière dépendante de la longueur de la chaîne in situ où les AHL à longue chaîne étaient préférentiellement inactivés (Figure 1), ce qui est cohérent avec les observations d'une proportion plus élevée d'isolats capables de dégrader les AHL à longue chaîne (100% des extincteurs AHL) par rapport aux AHL à chaîne courte et moyenne (~ 23% des extincteurs AHL; Figure 2). Ainsi, les activités QQ du spectre des isolats collectés se reflétaient plus généralement dans les types de signaux dégradés par l'ensemble de la communauté in situ. Cette observation correspondait également au profil des AHL qui ont été identifiés dans la communauté des boues floconneuses, où seuls les AHL avec des chaînes acyle courtes ou moyennes ont été détectés à de faibles concentrations, tandis que les signaux avec de longues chaînes acyle ⩾10 carbones n'ont pas été détectés du tout (Figure supplémentaire S4). Presque tous les isolats QS ont produit au moins un AHL à longue chaîne (tableau supplémentaire S5), ce qui suggère que la communauté des boues a la capacité de synthétiser les signaux à longue chaîne in situ. Ainsi, l'absence d'AHL à longue chaîne dans les boues n'était pas due à l'absence de souches productrices et est très probablement une conséquence de l'activité QQ spécifique de la communauté.

Les études d'isolement ont indiqué que la communauté de boues floculaires était dominée par les extincteurs de signal (60 % ; Figure 2), et cela s'est également reflété dans l'analyse de l'ensemble de la communauté où > 70 % des 50 membres les plus abondants de la communauté étaient négativement corrélés avec l'accumulation d'AHL (Figure 4 ; panneau de gauche - Groupe 3). Bien que de nombreux facteurs aient pu contribuer aux relations négatives, un facteur clé pourrait être que les membres de la communauté du groupe 3 étaient des extincteurs potentiels qui s'opposent à l'accumulation de signaux. À l'appui de cela, l'un des membres du cluster, Tag 43 (Diaphorobacter nitroreducens R042), a été isolé et confirmé comme étant un extincteur AHL (tableau supplémentaire S2). Les proportions plus élevées d'extincteurs de signal par rapport aux producteurs dans l'ensemble de la communauté peuvent donc expliquer les demi-vies courtes des AHL, et donc les faibles concentrations d'AHL au stade flocculaire (Figure 1 et Figure supplémentaire S6). À l'inverse, il y a eu un changement dans la communauté vers QS, c'est-à-dire des corrélations positives, avec une diminution concomitante des organismes QQ, c'est-à-dire des corrélations négatives, lorsque la biomasse a été transformée de flocs en granules (Figure 4, panneau de droite). Par exemple, Lysobacter brunescens R037 (Figure 4, panneau de droite—Tag 6 dans les boues granuleuses), un producteur de signal qui a été isolé de la communauté, était presque indétectable au stade flocculaire mais était très abondant pendant la granulation. bien qu'il ne soit pas encore possible de déterminer si le passage de la communauté des organismes QQ potentiels aux organismes QS est une cause directe de la granulation, ou si la granulation favorise l'enrichissement des organismes QS par rapport aux espèces QQ, les fortes associations entre les communautés et les granules dominés par QS, et les communautés et flocs dominés par QQ, suggèrent que la signalisation différentielle AHL est importante dans les fonctions au niveau de la communauté, telles que sous forme de granulation.

La cooccurrence des activités QS et QQ identifiées ici est probablement commune à de nombreux habitats. En effet, les organismes connus pour être des producteurs ou des extincteurs d'AHL, notamment les phylums Proteobacteria, Bacteriodetes, Firmicutes et Actinobacteria, ont été récemment élargis pour inclure également les cyanobactéries,44,45 Acidobacteria,46 Bacteriodetes47–49 et Archaea50 provenant d'un large éventail d'environnements. De plus, bon nombre de ces espèces coexistent dans les mêmes niches, telles que le rumen,15,51 les tapis microbiens14 et le sol/rhizosphère.7,8 C'est probablement aussi le cas pour les installations de traitement des eaux usées, qui abritent une très grande diversité microbienne, y compris de nombreux organismes QS et QQ identifiés dans cette étude et dans la littérature.6,17 En effet, notre analyse métagénomique préliminaire et nos études d'expression suggèrent que plusieurs gènes QS et QQ sont présents dans la usine à grande échelle (données non présentées), soutenant non seulement la cooccurrence des activités QS et QQ dans la communauté des bioréacteurs, mais également que le comportement de la communauté est contrôlé par l'activité combinée des organismes QS et QQ présents, ainsi que la spécificité de l'activité QQ pour des signaux AHL particuliers.

En conclusion, il ressort clairement de cette étude que si une corrélation positive entre la signalisation AHL et l'assemblage de biofilms granulaires microbiens a déjà été établie,19 les mécanismes détaillés par lesquels les membres de la communauté ayant des activités QS et QQ distinctes interagissent pour réguler les comportements QS au niveau communautaire restent à définir. Cette étude a développé le système de granulation comme un système expérimental comprenant une grande diversité d'espèces pour étudier et déterminer, de manière mécaniste, comment ces communautés contrôlent les comportements complexes au niveau du système, tels que la granulation. Notre étude fournit des preuves solides que la signalisation QS médiée par l'AHL est un véritable trait communautaire, avec> 65% des membres de la communauté de divers taxons engagés dans les processus de signalisation et d'extinction. L'abondance dynamique des organismes QS et QQ, ainsi que leurs cinétiques respectives de signalisation et d'extinction, semblent avoir un rôle clé pour définir le gradient de signal global, et donc réguler la transition des biofilms floconneux aux biofilms granulaires. Il est important de noter que ces résultats peuvent également impliquer que l'assemblage communautaire complexe est un processus de développement entraîné par la signalisation QS, avec l'enrichissement de membres spécifiques de la communauté avec des propriétés de signalisation QS et l'exclusion des membres avec des traits de signalisation anti-QS. L'observation selon laquelle les activités QS et QQ sont associées à des espèces microbiennes phylogénétiquement diverses que l'on trouve couramment dans de nombreux habitats naturels différents, dans des écosystèmes artificiels ainsi que dans des contextes cliniques, suggère fortement que la communication communautaire médiée par AHL pourrait être une caractéristique générale des communautés complexes, et que les activités QS et QQ peuvent jouer un rôle important dans la sélection d'assemblages microbiens stables et fonctionnels.

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Nous remercions Yehuda Cohen pour ses précieux commentaires sur le manuscrit. Remerciements particuliers à Zhaoqi Zhan, Peiting Zeng et Edwin Ting pour leur aide à la quantification AHL, et à Shimazdu Singapore pour avoir fourni l'utilisation de LC-MS/MS. CHT a été soutenu par la National Research Foundation (NRF) de Singapour dans le cadre de son programme de bourses de doctorat en technologies de l'environnement et de l'eau NRF et administré par le bureau du programme de l'industrie de l'environnement et de l'eau. La recherche a été soutenue par le Centre de Singapour pour l'ingénierie des sciences de la vie environnementale, dont la recherche est financée par la NRF et le ministère de l'Éducation de Singapour, l'Université technologique de Nanyang et l'Université nationale de Singapour, dans le cadre de son programme de centre d'excellence de recherche.

Centre de Singapour sur l'ingénierie des sciences de la vie environnementale (SCELSE), Université technologique de Nanyang, Singapour

Chuan Hao Tan, Kai Shyang Koh, Chao Xie, Guo Ping Lee, Scott A Rice et Staffan Kjelleberg

Advanced Environmental Biotechnology Center (AEBC), Nanyang Environment and Water Research Institute (NEWRI), Nanyang Technological University, Singapour

Chuan Hao Tan, Yan Zhou et Wun Jern Ng

École de génie civil et environnemental, Université technologique de Nanyang, Singapour

Chuan Hao Tan, Joel Zhang, Yan Zhou et Wun Jern Ng

École des sciences biologiques, Université technologique de Nanyang, Singapour

Xiao Hui Tan, Guo Ping Lee, Scott A Rice et Staffan Kjelleberg

Centre for Marine Bio-Innovation and School of Biotechnology and Biomolecular Sciences, University of New South Wales, Sydney, Australie

Scott A Rice et Staffan Kjelleberg

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CHT, KSK, YZ, WJN, SAR et SK ont conçu la recherche ; CHT, JZ, XHT et GPL ont effectué la recherche ; CHT, KSK, CX, YZ, WJN, SAR et SK ont analysé les données ; et CHT, SAR et SK ont rédigé l'article.

Correspondance à Staffan Kjelleberg.

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.

Des informations supplémentaires accompagnent l'article sur le site Web npj Biofilms and Microbiomes (http://www.nature.com/npjbiofilms)

Ce travail est sous licence internationale Creative Commons Attribution 4.0. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans la ligne de crédit ; si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons, les utilisateurs devront obtenir l'autorisation du titulaire de la licence pour reproduire le matériel. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Réimpressions et autorisations

Tan, C., Koh, K., Xie, C. et al. Signalisation et extinction de détection de quorum communautaire : assemblage de biofilm granulaire microbien. npj Biofilms Microbiomes 1, 15006 (2015). https://doi.org/10.1038/npjbiofilms.2015.6

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Reçu : 03 janvier 2015

Révisé : 24 mars 2015

Accepté : 07 avril 2015

Publié: 27 mai 2015

DOI : https://doi.org/10.1038/npjbiofilms.2015.6

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