Création d'une saline | Nanning Paon Pride Co., Ltd

Communications Biology volume 5, Article number: 1352 (2022) Citer cet article

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Le rejet d'eaux usées industrielles, la production agricole, le transport maritime, l'extraction de pétrole et d'autres activités ont causé une grave pollution marine, notamment des microplastiques, du pétrole et ses produits, des métaux lourds, des pesticides et d'autres matières organiques. L'efficacité de la bioremédiation des pollutions marines peut être limitée par des concentrations élevées de sel (> 1 %, p/v), qui peuvent entraîner une perte apparente d'activités microbiennes. Dans cette étude, les promoteurs fonctionnels P1, P2-1 et P2-2 censurant le stress salin ont été isolés et identifiés à partir d'une souche Vibrio natriegens Vmax. Trois modèles de dégradation induite par le sel ont été construits pour dégrader le polyéthylène téréphtalate (PET), le chlorpyrifos (CP) et les hexabromocyclododécanes (HBCD) à l'aide de la souche marine Vmax. Les souches modifiées sont efficaces pour la dégradation des substrats correspondants, avec des taux de dégradation à 15 mg/L PET en 8 jours, 50 mg/L CP en 24 h et 1 mg/L HBCD en 4 h, respectivement. De plus, une stratégie d'immobilisation pour le recyclage et la réutilisation des souches modifiées a été réalisée en exprimant la protéine de liaison à la chitine GbpA. Cette étude peut aider à répondre à l'utilisation de bactéries marines à croissance rapide telles que V. natriegens Vmax pour dégrader efficacement la pollution marine.

Avec les progrès rapides de l'industrie et de l'agriculture, la grave pollution de l'environnement marin est devenue un problème majeur pour le développement économique et social, en particulier dans les pays en développement1. La pollution marine, y compris les métaux lourds, le pétrole, les polluants organiques persistants (POP), les débris et les radionucléides, peut être directement ou indirectement nocive pour les organismes vivants et les ressources2. La pollution plastique s'est intensifiée au cours des 50 dernières années et le contenu estimé de plastique dans le milieu marin est supérieur à 250 000 tonnes3. L'élimination des microplastiques par sorption et filtration a été construite, comme l'absorption des particules microplastiques à la surface des algues vertes marines, la filtration des microplastiques par la technologie membranaire, et même la combinaison avec des bioréacteurs à membrane, avec une efficacité d'élimination atteignant 97,2 %4. Deux types de souches de Bacillus isolées des sédiments de la mangrove se sont avérées dégrader différents microplastiques avec une réduction de seulement 0,0019 mg/jour5.

Cependant, la dégradation des microplastiques dans l'eau de mer a peu été étudiée et seul un nombre limité de bactéries sont capables de dégrader les contaminants dans des conditions marines avec une plage de salinité comprise entre 3,3 et 3,7 %.

Les bactéries halotolérantes sont capables d'accumuler des concentrations élevées de divers solutés osmotiques organiques (OOS), tels que des solutés compatibles (sucres hydrosolubles ou alcools de sucre, autres alcools, acides aminés ou leurs dérivés), ectoïne, tréhalose et glycine bétaïne, etc.6,7,8,9,10. Ces OOS pourraient aider à maintenir un équilibre osmotique du cytoplasme avec l'environnement extérieur, en maintenant les activités biologiques normales des cellules. De nombreux organismes marins sont légèrement halophiles (avec 3 % m/v de NaCl dans l'eau de mer).

La souche Vmax de V. natriegens, isolée du milieu marin, a un temps de génération inférieur à 10 min et ne peut se développer sans NaCl, avec une concentration optimale de 2 à 3 % (p/v)11. Des cassettes contenant le gène de l'ARN polymérase T7 sous le contrôle d'un promoteur inductible par l'IPTG ou l'arabinose (lacUV5 et araBAD, respectivement) ont été insérées dans le grand chromosome de V. natriegens (ATCC 14048, la souche originale de V. natriegens Vmax). Lorsque des plasmides d'expression contenant le gène GFP sous le contrôle du promoteur T7 ont été introduits, une expression robuste de la GFP a été détectée12. Cependant, il y a eu peu de rapports sur l'utilisation de V. natriegens comme hôte pour la dégradation des polluants environnementaux, en particulier dans le milieu marin.

Dans cette étude, la souche Vmax a été utilisée pour dégrader les polluants environnementaux sous stress salin. Tout d'abord, les mécanismes de tolérance au sel de la souche Vmax ont été proposés par analyse transcriptomique, et les promoteurs induits par le sel associés ont été identifiés et caractérisés. Trois modèles ont ensuite été construits pour dégrader le chlorpyrifos (CP), les hexabromocyclododécanes (HBCD) et le polyéthylène téréphtalate (PET), sur la base des promoteurs identifiés. Le recyclage utilisé pour les souches modifiées a été contrôlé en les liant à des matériaux de chitine, qui sont spécifiques aux espèces de Vibrio et abondants dans le milieu marin.

Afin de trouver des éléments exprimés de manière constitutive induits par le sel (NaCl ou Na+), une analyse transcriptomique comparant le groupe de traitement (souche Vmax cultivée avec 5 % (p/v) de NaCl) au groupe témoin (souche Vmax cultivée avec 1 % de NaCl) a été réalisée. Des échantillons pour l'analyse transcriptomique ont été prélevés en phase exponentielle et les niveaux de transcription génique avec des changements de pli dans Log2 ont été regroupés dans une carte thermique (Fig. 1a). Au total, 1596 gènes ont été identifiés, dont 728 gènes étaient régulés positivement et 868 gènes étaient régulés négativement. Les gènes régulés à la hausse pourraient être divisés en 25 catégories par analyse GO (Fig. 1b), l'activité catalytique étant la plus régulée. Les gènes régulés à la hausse impliqués dans la voie métabolique KEGG ont ensuite été divisés en six branches, dont les gènes liés aux transporteurs ABC (ko02010) et aux systèmes à deux composants (ko02020) ont été les premiers gènes abondants (Fig. 1c).

a La carte thermique, basée sur une analyse hiérarchique utilisant le log2 (5 %/1 %) pour chaque gène dans deux groupes (5 et 1 %), a montré que 1 596 gènes ont été détectés. Les couleurs allaient du bleu au rouge, représentant les valeurs de log2 (5%/1%). b Catégories GO significativement enrichies pour les gènes avec des changements de pli dans Log2 ≥ 4. c Classification différentielle de la voie KEGG du gène pour les gènes avec des changements de pli dans Log2 ≥ 4. d Mécanisme halophile proposé de la souche Vmax basé sur l'analyse du transcriptome.

Pour identifier les éléments potentiels associés au stress salin, des gènes ont été sélectionnés qui ont été régulés à la hausse de plus de 4 fois (tableau supplémentaire 3). Trois groupes de gènes liés au stress salin, y compris le groupe de gènes de biosynthèse de l'ectoïne ectBACD (régulé à la hausse de 8,96, 9,47 et 8,52 fois), les transporteurs proline/glycine bétaïne ABC proWXV (régulés à la hausse de 9,02, 8,86 et 8,79 fois) et les gènes de biosynthèse de la bétaïne BCCT (régulés à la hausse de 6,20, 6,09 fois), ainsi qu'un groupe concernant l'assemblage de la flagelline (régulé positivement par 7,16, 5,59, 5,43, 4,38, 4,24 et 4,07 fois) figuraient parmi les 52 gènes régulés positivement13. L'antiport Na + / H + fonctionne généralement en transportant des ions sodium pour maintenir la pression osmotique intracellulaire, et son gène d'édition NhaC a été régulé à la hausse de 4, 49 fois. Sur la base des résultats de l'analyse transcriptomique, nous proposons que le mécanisme de tolérance au sel de la souche Vmax implique la sécrétion de solutés compatibles, tels que l'ectoïne ou la proline/glycine bétaïne, et l'amélioration du transport de Na+ via des niveaux de transcription régulés à la hausse des gènes correspondant à la synthèse ou aux canaux (Fig. 1d).

Les promoteurs qui peuvent être induits par le stress salin sont des éléments importants pour la survie des micro-organismes dans des environnements particuliers. Pour identifier les éléments promoteurs potentiels induits par le sel, la séquence avant de 400 pb des gènes/groupes de gènes les plus régulés positivement a été sélectionnée comme candidat. La plupart des gènes régulés positivement étaient répartis de manière aléatoire dans tout le génome, avec les deux groupes de gènes régulés positivement ectBACD et proWXV, dans des directions opposées. Fait intéressant, une zone d'intervalle de 717 paires de bases entre les deux groupes a été identifiée et devrait contenir trois promoteurs avec deux directions (Fig. 2a). La direction de transcription du promoteur P1 (AAACACTTTATAAAGTCCCTTAACTTCCAGTATGGGGTCCATGTAATCGT) a été appariée au groupe de gènes proWXV, et la direction de transcription des promoteurs P2 (P2-1 : TTCAGAAGCTGTTAATAGCGCGGGGGATCGTAAATTAGAAAATA ATATAT ; P2-2 : TAAGGGACTTTATAAAGTGTTTGGTGAGAACCCAGAGCGT GCTTTCTCAC) étaient les mêmes que pour les clusters ectBACD.

a Schéma de deux groupes de gènes régulés positivement, avec trois promoteurs proposés. (La couleur représente la régulation à la hausse des gènes de réponse ; les séquences indiquent la zone proposée pour les promoteurs, et les lettres agrandies représentent le site de départ pour la transcription). b Organigramme d'identification et de caractérisation des promoteurs proposés. c Détection de l'intensité de fluorescence pour mRFP/eGFP dans la cellule unitaire. P1 (cluster avant de séquence de gène de 400 bp proWXV), P2-1 (cluster de gène avant de séquence de 400 bp inverse ectBACD) ou P2-2 (cluster avant de séquence de 400 bp inverse proWXV) et la zone d'intervalle pleine longueur (P12, et sa séquence inversée était P21). Les barres d'erreur sont l'erreur standard de la moyenne.

La région contenant les promoteurs P1, P2-1 et P2-2 a été en outre caractérisée par ligature à pS8K-mRFP. Une expression hautement visible de la protéine fluorescente rouge (mRFP) a été détectée et l'activation bidirectionnelle simultanée a été mesurée avec un gène de protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) (Fig. 2b). Sous un stress Na + de 3%, les régions tronquées, qui ne contiennent que les promoteurs P1 (400 bp sequence front cluster proWXV), P2-1 (reverse 400 bp sequence front gene cluster ectBACD), P2-2 (reverse 400 bp sequence front cluster proWXV), ou la zone d'intervalle pleine longueur (P12, et sa séquence inversée était P21), ont une activité transcriptionnelle (Fig. 2c). Lorsque la transcription du gène mRFP a été initiée avec le promoteur P2-2, la plus forte fluorescence a été détectée.

Pour tester et vérifier la capacité des promoteurs identifiés à se dégrader, trois modèles de dégradation ont été construits et caractérisés. Les principaux gènes fonctionnels liés à la dégradation de CP ont été construits sous le contrôle des promoteurs P1 et P2-1 (Fig. 3a, b), résultant en Vmax-mpdp12tcpXA. Ici, environ 50 % de CP avec une concentration initiale à 100 mg/L pourraient être dégradés en 8 h. De plus, le système enzymatique de catalyse contenant une cytochrome monooxygénase (CYP168A1), une ferrédoxine 4Fe-4S (Fd) et une ferrédoxine réductase (FNR) NAD (P) H-dépendante de P. aeruginosa HS9 ont été construits (Fig. 3c), résultant en la souche Vmax-cyp168A1p12FdFNR. Les HBCD (1 mg / L) pourraient être complètement convertis en produits débromés, y compris les pentabromocyclododécanols (PBCDOH) et les tétrabromocyclododécadiols (TBCDDOH) en 8 h (Fig. 3d).

a Base de recherche sur la dégradation du chlorpyrifos (CP) et le diagramme plasmidique de la dégradation du CP induite par le sel. b Vérification de l'efficacité métabolique du pesticide CP. c Base de recherche sur la dégradation de l'hexabromocyclododécane (HBCD) et le diagramme plasmidique de la dégradation de l'HBCD induite par le sel. d Vérification de l'efficacité métabolique des HBCD.

Pour améliorer l'efficacité de la transcription, un troisième modèle a été construit avec la zone promotrice raccourcie de P1 à P2-2. Comme la PETase ou la LCC pourraient catalyser le PET en acide mono-(2-hydroxyéthyl) téréphtalique (MHET) et en acide bis-(2-hydroxyéthyl) téréphtalique (BHET) comme produits principaux, la MHETase ou la Tfca peuvent catalyser BHET et MHET en éthylène glycol (EG), acide téréphtalique (TPA) et autres composants dans des conditions douces (Fig. 4a). Ici, quatre hydrolases de PET modifiées avec l'activité catalytique la plus élevée ont été choisies pour construire des souches de dégradation de PET induites par le sel. La dégradation du PET a été confirmée par la génération des produits d'hydroxylation BHET et MHET. Les cellules entières et les cellules brutes pouvaient dégrader le PET, et les efficacités de dégradation différaient (Fig. 4b, c). Pour les cellules entières, les taux de dégradation des quatre constructions modifiées sont classées comme Vmax-MHETaseP122PETase (MPP) > Vmax-PETaseP122MHETase (PPM) > Vmax-TfcaP122LCC (TPL) > Vmax-LCCP122Tfca (LPT). Les produits BHET et MHET ont été détectés avec une accumulation maximale à 10 mg/L et 11 mg/L après 8 jours dans les constructions MPP (Fig. 4b). Pour les enzymes brutes des constructions PPM, BHET et MHET se sont accumulés à 5, 0 et 40 mg / L au cours des 24 premières heures et ont diminué à 0 à 48 h, respectivement (Fig. 4c). Pour les enzymes brutes des constructions MPP, BHET et MHET se sont accumulés à 127 et 14 mg/L au cours des premières 24 h et 60 h, respectivement. Pour les enzymes brutes des constructions LPT, BHET et MHET se sont accumulés à 105 mg/L et 48 mg/L au cours des 24 premières heures. Pour les enzymes brutes des constructions TPL, le BHET s'est accumulé à 128 mg/L en 120 h, tandis que le MHET s'est accumulé à 76,5 mg/L en 24 h, puis a diminué à 11 mg/L à 120 h. Les activités des enzymes brutes étaient plus fortes que les activités des cellules entières, en raison de la température appropriée pour les enzymes. Les changements dans la morphologie de surface des échantillons de membrane PET, traités par les souches PPM, MPP, LPT et TPL, ont été montrés sur la figure 4d. Par rapport au PET non traité, divers degrés de fragmentation ont été détectés pour les échantillons traités. Pour la dégradation de la membrane PET, le changement le plus évident a été observé dans les échantillons de MPP, qui correspondait à l'accumulation de produits de dégradation.

a Combinaison de PET hydrolases pour la dégradation du polyéthylène téréphtalate (PET) dans ce travail : PETase + MHETase ou LCC + Tfca. b Accumulation des produits acide mono-(2-hydroxyéthyl) téréphtalique (MHET) et acide bis-(2-hydroxyéthyl) téréphtalique (BHET) dans les systèmes de dégradation des cellules entières des quatre souches PET modifiées. Les cartes du plasmide construit sont dessinées en gris. c Accumulation des produits MHET et BHET dans les systèmes enzymatiques bruts des quatre souches de dégradation du PET modifié. d Changements de la morphologie de surface d'échantillons de membrane PET vérifiés par un microscope à force atomique (AFM) (NANOCUTE II, Seiko Instruments Inc.).

Pour obtenir une meilleure application des souches artificielles dans la bioremédiation environnementale, la prévention des fuites de souches artificielles est essentielle pour la sécurité environnementale et écologique. La protéine de liaison à la chitine GbpA de Vibrio cholerae a été ajoutée aux souches Vmax modifiées (Vmax-cyp168A1p12FdFNR) dans le vecteur pMD18T, ce qui a donné Vmax-GbpA-cyp168A1p12FdFNR (VgHBCD). Dans cette souche modifiée, une protéine de 53 kDa a été exprimée et détectée par SDS-PAGE, qui correspondait au poids moléculaire de la protéine GbpA, et l'adhésion de VgHBCD à la chitine a été multipliée par environ 2 (Fig. 5a, b). Le biofilm a pu être observé au microscope électronique à balayage (SEM) à la surface de la chitine (Fig. 5c). Lorsque le matériau de chitine adhérant au VgHBCD a été lavé avec un tampon NSS pour tester le potentiel de récupération, environ 80 % du biofilm bactérien a été retenu à la surface de la chitine. De plus, la capacité de dégradation des HBCD du VgHBCD lorsqu'il est lié à la chitine a été détectée après chaque lavage.

a Analyse de l'expression de la protéine de liaison à la chitine GbpA par SDS-PAGE. M, marqueur protéique ; voies 1 à 3, enzyme brute, surnageant, précipité de la souche Vmax ; voies 4 à 6, enzyme brute, surnageant, précipité de la souche Vmax-GbpA. b Mesure de la liaison de la biomasse à la chitine par un kit de dosage du 3-(4,5)-diméthylthiahiazo (-z-y1)-3,5-diphénytétrazoliumromide (MTT). Les barres d'erreur sont l'erreur standard de la moyenne. c Morphologie de la chitine bio-ancrée au microscope électronique à balayage (SEM) S3400II (Hitachi, Japon) avec une tension d'accélération de 20 kV. d–f Vérification du taux de récupération et de l'effet de dégradation des souches fixées à la chitine pour les HBCD, le CP et le mPET, respectivement.

Les taux de dégradation des HBCD étaient de 50 % au premier tour et de 100 % aux deuxième et troisième tours (Fig. 5d). La souche recombinante VgCP se liant à la chitine pourrait complètement dégrader 100 mg / L de chlorpyrifos tous les trois fois recyclés (Fig. 5e). Les souches VgPPM, VgMPP, VgLPT et VgTPL se liant à la chitine pourraient dégrader le mPET, et les produits accumulés BHET et MHET ont été détectés par HPLC. Au premier tour, les produits BHET et MHET se sont accumulés de manière substantielle, et plus faiblement aux deuxième et troisième tours (Fig. 5f).

En raison des activités industrielles, les environnements contaminés par des matières organiques subissent fréquemment un stress salin et hypersalin. Des concentrations élevées de sel (> 1 %, p/v) peuvent entraîner une perte d'activité microbienne, limitant l'activité enzymatique. Les stratégies pour surmonter ces problèmes comprennent l'adaptation des bactéries à une salinité élevée et l'utilisation de micro-organismes à haute tolérance au sel. Des informations limitées sur le mécanisme de réponse au sel de V. natriegens ont été rapportées, y compris son utilité en tant que plate-forme pour dégrader les polluants organiques.

Les mécanismes de réponse au sel de divers micro-organismes halophiles et halotolérants ont fait l'objet de recherches approfondies et comprennent le transport sélectif des ions inorganiques Na+/K+ dans le cytoplasme vers l'accumulation de substances organiques spécifiques de faible poids moléculaire, telles que l'ectoïne, la proline, la bétaïne, le tréhalose, l'acide choline-O-sulfurique et la carnitine. Les informations concernant la régulation transcriptionnelle de la biosynthèse concernent majoritairement la biosynthèse de l'ectoïne14. La plupart des bactéries tolérantes au sel signalées pourraient sécréter de petites molécules compatibles pour s'adapter au stress salin, telles que Methylotuvimicrobium alcaliphilum 20Z (NC_016112.1)15, Bacillus halodurans C-125 (BA000004.3)16, Streptomyces coelicolor A3 (AL645882.2)17, Halomonas elongata HEK1 (FN8695 68.2)18, et Chromohalobacterium saleexigens DSM 3043 (CP000285.1)19. Les gènes de biosynthèse de l'ectoine (groupe ectABC), situés dans le génome des bactéries ci-dessus, sont transcrits sous le contrôle des promoteurs induits par le sel adjacents au codon "ATG" d'ectA, tels que ectAp1, PectA, PectA, PectA1-4 et PectB, et PectA1-4 et PectB. Chez V. natriegens, le groupe de gènes ectABC était adjacent aux gènes du système de transport glycine bétaïne / proline, dans le sens opposé, sous le contrôle de trois promoteurs (Fig. 1 supplémentaire). L'emplacement des gènes liés au stress salin dans la souche Vmax présente un avantage évidemment spécifique à l'emplacement, par rapport aux autres micro-organismes halophiles ou halotolérants signalés. Les gènes liés à la transcription de Na+/K+ et à la biosynthèse de l'ectoïne, de la proline et de la bétaïne pourraient être amenés à s'exprimer presque en même temps. En conséquence, la distance réduite entre les deux groupes de gènes pour la synthèse de l'ectoïne et le transport de la bétaïne / proline chez V. natriegens par rapport aux autres bactéries halophiles et halotolérantes, ainsi que les promoteurs sensibles, a amélioré sa capacité à maintenir l'équilibre osmotique.

Compte tenu de la nécessité de la bioremédiation dans les environnements affectés par le sel, l'amélioration de la capacité de croissance et de dégradation des bactéries spécialisées sous stress salin est significative. Ainsi, il est de la plus haute importance d'évaluer le potentiel des promoteurs identifiés pour l'application pratique de la bioremédiation dans des environnements contaminés par des substances organiques avec un stress salin. Ici, trois modèles de dégradation ont été construits. Le chlorpyrifos (CP) est l'un des pesticides organophosphorés (OP) les plus largement utilisés, causant des dommages neurocomportementaux. Le taux de dégradation de Vmax-mpdp12tcpXA (50 mg/L en 24 h) était bien inférieur à celui de la bactérie de dégradation naturelle Stenotrophomonas sp. YC-1, qui peut dégrader 100 mg/L de CP en 18 h. Il est probable que l'expression des gènes sous le contrôle de P1 n'était pas suffisante pour métaboliser le premier produit, le 3, 5, 6-trichloro-2-pyridinol (TCP)20,21. Dans le deuxième modèle, les hexabromocyclododécanes (HBCD), qui sont les deuxièmes retardateurs de flamme bromés (RFB) les plus couramment utilisés ajoutés dans les matériaux de construction, l'électronique, les textiles et les plastiques, ont été sélectionnés comme substrat cible. Dans le processus de dégradation des composés organiques halogénés, la déshalogénation initiale est l'étape la plus cruciale. Ici, le taux de dégradation des HBCD a été multiplié par environ 10 par rapport à la souche HS9, avec un taux de dégradation de 0,64 mg/L sur 14 jours. Le taux de dégradation HBCD de Vmax-cyp168A1p12FdFNR était beaucoup plus rapide que le taux de dégradation de HS922,23. En raison de l'efficacité de l'apport d'électrons dans le modèle de dégradation des HBCD induit par le sel, contenant l'enzyme de catalyse CYP168A1 et les enzymes de fourniture d'électrons ferrédoxine (Fd) et ferrédoxine réductase (FNR), le taux de dégradation des HBCD a été fortement amélioré. Dans la présente étude, le micro-organisme marin V. natriegens a été utilisé comme hôte pour exprimer des enzymes de catalyse dépendant d'un facteur environnemental pour la croissance (Na+). L'utilisation de bactéries génétiquement modifiées dans l'environnement peut présenter certains risques en matière de biosécurité. Ils peuvent faire référence à l'accès non autorisé, à la perte, au vol, à l'utilisation abusive, au détournement ou à la diffusion intentionnelle. Si un accident de biosécurité se produisait, il constituerait une énorme menace pour les humains et la nature24. Nos études permettent de relever les défis (robustesse insuffisante des souches de laboratoire, expression dépendante des inducteurs chimiques) dans la construction de bactéries génétiquement modifiées destinées à être disséminées dans l'environnement.

Le problème de la pollution marine par les microplastiques a suscité une large attention, se classant parmi les dix principaux problèmes environnementaux émergents dans le monde. En raison de leur petite taille (diamètre < 5 mm), de leur large éventail de sources, de leurs grandes quantités et de la libération d'additifs, tels que des métaux et des polluants organiques toxiques, ces microplastiques entraînent une toxicité biologique importante. Les déchets plastiques sont répandus dans les eaux offshore, marines et les sédiments, et s'accumulent en permanence25. Bien que de nombreux types d'hydrolases PET aient été étudiés dans divers micro-organismes, notamment la cutinase, la lipase et la PETase. Les applications de ces enzymes aux bactéries d'ingénierie dégradant le PET dans le milieu marin sont limitées. Cependant, les cellules immobilisées peuvent présenter des activités catalytiques améliorées, raccourcir le temps de bioremédiation, réduire les coûts de production avec des risques de biosécurité moindres26. Dans notre étude, dans le modèle trois, les souches PPM, MPP, LPT et TPL pourraient dégrader le PET dans 0, 5 × NSS, indiquant que ces souches recombinantes de V. natriegens pourraient être utilisées dans les environnements marins pour biorémédier la pollution par le PET.

Cette étude aide à répondre à de nombreuses préoccupations concernant les faibles taux de croissance et de dégradation des micro-organismes naturels utilisés pour la bioremédiation sous un stress salin élevé dans le milieu marin. Marine V. natriegens devrait avoir un bon potentiel de bioremédiation de l'environnement marin pollué.

Le chlorpyrifos (CP, ≥ 99 % de qualité analytique), le 3,5,6-trichloro-2-pyridinol (TCP, ≥ 99 % de qualité analytique), le polyéthylène téréphtalate (PET), l'acide bis-(2-hydroxyéthyl) téréphtalique (BHET) et l'acide mono-(2-hydroxyéthyl) téréphtalique (MHET) ont été achetés auprès de Meryer (Shanghai, Chine). Les 1, 2, 5, 6, 9, 10-hexabromocyclododécanes (HBCD, qualité analytique ≥ 95 %) ont été achetés auprès d'Anpel Laboratory Technologies (Shanghai, Chine). L'acétate d'éthyle, le méthanol et tous les autres réactifs et solvants utilisés dans cette étude étaient de qualité analytique.

La souche Vmax de V. natriegens a été achetée auprès de Synthetic Genomic Company (Calipatria, CA). Pseudomonas aeruginosa HS9 a été obtenu au magasin du laboratoire22. Le milieu minimal de sels (MSM) utilisé dans ce travail contenait (par litre) 13,3 g de Na2HPO4·12H2O, 4 g de KH2PO4, 0,2 g de MgSO4, 2,0 g de NH4Cl, 9,5 g de NaCl et 0,5 ml de solution de stockage d'oligo-éléments. La solution de réserve d'oligoéléments consistait en (par litre) 0,05 g CaCl2·2H2O, 0,05 g CuCl2·2H2O, 0,008 g MnSO4·H2O, 0,004 g FeS·7H2O, 0,1 g ZnSO4, 0,1 g Na2MuO4·2H2O et 0,05 g K2WuO4·2H2O, et pH 7 .0. Le milieu de solution proche des sels (NSS) contenait (par litre) 8,8 g de NaCl, 0,735 g de Na2SO4, 0,125 g de KCl, 0,02 g de KBr, 0,935 g de MgCl2·6H2O, 0,205 g de CaCl2·2H2O, 0,004 g de SrCl2·6H2O et 0,004 g de H3BO327.

L'analyse transcriptomique a été réalisée en comparant le profil de transcription des cellules incubées dans le milieu avec une concentration finale de 1 et 5 % (p/v) de NaCl. La souche Vmax a été cultivée dans des flacons de 2 L contenant 1 L de bouillon Luria-Bertani à 5 % de NaCl (LB5). Pour le groupe témoin, la souche Vmax a été cultivée dans un bouillon de lysogénie (LB). Tous les échantillons ont été cultivés dans des agitateurs thermostatiques à 30 °C à 200 tr/min. Les cellules ont été récoltées lorsque la DO600 a atteint 0, 6 à 0, 8 pour le séquençage du transcriptome, congelées à l'azote liquide et stockées à -80 ° C avant le séquençage. L'ARN total extrait a été détecté par la plateforme DNBSEQ (BIG, Shenzhen, Chine). Les gènes avec des niveaux de transcription élevés sous une concentration élevée de sel (5 % de NaCl) (changement de régulation à la hausse ≥ 4) ont été résumés comme candidats à la recherche. Les lectures nettes ont été appariées à la séquence du génome par le programme Hierarchical Indexing for Spliced Alignment of Transcripts (HISAT)28,29.

Pour déterminer l'activité des promoteurs proposés (séquence avant de 400 pb), la zone d'intervalle a été ligaturée pour cloner le vecteur pSK8k-mRFP entre les sites PstI et EcoRI. Les séquences avant ont été amplifiées à partir de l'ADN génomique de Vmax, à l'aide des amorces décrites dans le tableau supplémentaire 1. Les fragments purifiés ont été ligaturés à pSK8k-mRFP linéaire à l'aide d'un kit de clonage en une étape 2 × ClonExpress MultiS (Vazyme, Nanjing, Chine). Les régions contenant les promoteurs P1 et P2 ont été davantage vérifiées par ligature à pS8K-mRFP. Les vecteurs résultants ont été transférés à la souche Vmax par électro-transformation et les cellules compétentes ont été préparées comme suit, la souche Vmax a été cultivée dans 3% LB, les cellules ont été cultivées dans des agitateurs thermostatiques à 30 ° C à 200 tr / min et récoltées lorsque la DO600 a atteint 0, 6–0, 8, les cellules ont été lavées avec le tampon de lavage (7 mM K2HPO3 et 680 mM de saccharose) deux fois et remises en suspension avec le tampon de lavage8. L'intensité de fluorescence de GFP et RFP a été déterminée à l'aide d'un lecteur de microplaques multimode 20 M (Tecan & Spark, Suisse) avec excitation à 510 nm et lecture de l'émission à 485 nm pour GFP et avec excitation à 607 nm et lecture de l'émission à 584 nm pour RFP30,31. La croissance cellulaire a été mesurée à 600 nm. L'activité unitaire des promoteurs a été calculée par :

Les gènes optimisés en codons impliqués dans la métabolisation du chlorpyrifos (CP) ont été synthétisés par la société GENEWIZ (Suzhou, Chine). Les numéros d'accès des gènes dégradant la CP mpd, tcpX, tcpA, dhpI et dhpJ étaient respectivement ABD92793.1, AGC65457.1, AGC65458.1, KC294623.1 (2341–3056) et KC294623.1 (3081–3959). Dans le modèle de dégradation des HBCD, le gène cyp168A1, une ferrédoxine 4Fe-4S (Fd) et une ferrédoxine réductase (FNR) NAD(P)H-dépendante ont été amplifiés à partir de P. aeruginosa HS9. Les PET hydrolases PETase, MHETase, LCC et Tfca ont été synthétisées avec les séquences des références 32, 33, 34, 35 comme matrices par la société GENEWIZ. Toutes les amorces utilisées sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 2. Les voies de dégradation des CP/HBCD ont été positionnées dans le vecteur clone pAMmcs entre les sites EcoRI et XhoI. Le gène inverse mpd/cyp168A1 était sous le contrôle du promoteur P2-1, tandis que les autres gènes (tcpXA-dhpIJ/FdFNR) étaient contrôlés par le promoteur P1, résultant en pAM-mpdp12tcpXA et pAM-cyp168A1p12FdFNR, respectivement. Les hydrolases PET, PETase32, MHETase33, LCC34 et Tfca35, ont été construites dans le même vecteur pSK8k que le promoteur d'identification de l'activité, sous le contrôle des promoteurs P1 et P2-2.

Après électrotransformation en souche Vmax, des clones uniques ont été vérifiés par PCR, obtenant les constructions Vmax-mpdp12tcpXA, Vmax-cyp168A1p12FdFNR, Vmax-PETaseP122MHETase (PPM), Vmax-MHETaseP122PETase (MPP), Vmax-LCCP122Tfca (LPT) et Vmax-TfcaP122LCC (TPL). Pour déterminer leur capacité à dégrader le PET, le CP ou les HBCD, les souches modifiées cultivées jusqu'à la phase logarithmique dans un bouillon de lysogénie à 5% de NaCl (LB5) ont été collectées et lavées trois fois avec le milieu 0, 5 × NSS et remises en suspension avec 0, 5 × NSS. La densité optique finale a été ajustée à une DO6oo de 1,0. Un gramme de PET (contenant 0,5 g de micro-PET et 0,5 g de membrane PET), 100 mg/L de CP ou 1 mg/L de HBCD ont été ajoutés à 20 mL de lysat cellulaire comme substrat, séparément, toutes les réactions ont été réalisées à 30 °C. Un ml de mélange réactionnel a été extrait du système réactionnel tous les 2 jours. De l'acide chlorhydrique (1%) a été ajouté aux échantillons pour terminer la réaction. Tous les échantillons ont été stockés à -80 ° C jusqu'à leur utilisation, et trois échantillons biologiquement indépendants ont été détectés pour chaque point36,37. Pour les tests d'activité enzymatique brute, la suspension cellulaire remise en suspension a été brisée par un homogénéisateur haute pression (APV-2000, Allemagne) à 4 ° C, puis les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation à 10 000 tr / min pendant 40 min. Un gramme de PET a été ajouté à 20 ml du surnageant comme substrat, et la réaction avec les constructions PPM, MPP, LPT et TPL a été effectuée avec les agitateurs thermostatiques à 44 ° C et 55 ° C, respectivement. De plus, 1 ml de mélange réactionnel a été extrait du système réactionnel toutes les 2 h, les échantillons ont été préparés et détectés avec les mêmes méthodes que les échantillons de dégradation des cellules entières.

L'immobilisation des souches Vmax modifiées sur la chitine a été réalisée pour éviter les fuites biologiques et permettre le recyclage continu de la micro-ressource en dégradation38,39. Le gène (numéro d'accès CP047296.1, 755825–757282) codant pour la protéine de liaison à la chitine GbpA a été amplifié à partir de Vibrio cholerae40,41, avec l'amorce GbpAF : 5'-ATGAAAAAAACAACCT-3', GbpAR : 5'-TTAACGTTTATCCCACG-3'. Le produit amplifié a été ligaturé dans pMD18T-Blunt Vector (TransGen Biotech, Chine) puis transformé dans E. coli Top1042. Les transformants ont été séquencés à l'aide des amorces universelles M13F-GbpAF ou M13R-GbpAR après extraction du plasmide. Le vecteur résultant, pMD18T-GbpA, a été transféré à la souche Vmax-mpdp12tcpXA, Vmax-cyp168A1p12FdFNR, Vmax-PETaseP122MHETase (PPM), Vmax-MHETaseP122PETase (MPP), Vmax-LCCP122Tfca (LPT) et Vmax-TfcaP122LCC (TPL), formant respectivement Vmax- GbpA-mpdp12tcpXA (VgCP), Vmax-GbpA-cyp168A1p12FdFNR (VgHBCD), Vmax-GbpA-PETaseP122MHETase (VgPPM), Vmax-GbpA-MHETaseP122PETase (VgMPP), Vmax-GbpA-LCCP122Tfca (VgLPT) et Vmax-GbpA-Tf constructions caP122LCC (VgTPL).

Les souches modifiées Vg ont été cultivées jusqu'à la phase logarithmique dans LB5, collectées et lavées trois fois avec le milieu NSS. Ensuite, 2 mL de culot cellulaire ont été remis en suspension avec 350 mL de NSS, additionnés de 100 mg/L de CP, 10 mg/L de HBCD et 0,1 g de micro-PET (mPET). La suspension résultante a été ajoutée à 0,3 g de chitine stérilisée (CAS : 1398-61-4) (Sigma-Aldrich, Amérique) dans une bouteille en verre de 5 ml, avec 1 ml de tampon 0,5 × NSS ajouté au système réactionnel. La réaction de liaison a été incubée en stationnaire à 30 ° C pendant 3 jours. Pour tester l'efficacité des bactéries recyclées, la souche de dégradation de HBCD engendrée a été prise comme module pour calculer les taux de HBCD restants trois fois, en détectant les concentrations de HBCD restantes. Les bactéries solides liant la chitine ont été lavées trois fois avec le milieu NSS pour recyclage en utilisant (centrifugation à 3000 tr/min pendant 2 min). En raison de la fonction de la protéine de liaison à la chitine GbpA, l'efficacité des souches modifiées Vg se liant à la chitine a été améliorée. La liaison de la biomasse à la chitine a été mesurée via un kit de dosage (3-(4,5)-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazoliumbromure (MTT). La souche a été incubée et additionnée de 100 μL de MTT (5 g/L) et maintenue dans l'obscurité pendant 4 à 5 h, après quoi 100 μL de DMSO ont été ajoutés et lus à 570 nm. Le pourcentage de mortalité a été calculé43. Les concentrations des substrats ajoutés ont été détectées avec la même méthode que dans la section 2.5.

Des échantillons pour la dégradation du CP et du HBCD ont été préparés en ajoutant d'abord du NaCl aux échantillons stockés en excès. De l'acétate d'éthyle a ensuite été ajouté à un rapport volumique de 1:1 pour extraire le substrat. Ensuite, le mélange a été vortexé pendant 30 s avec un oscillateur vortex (YETO, vortex-2, Chine) suivi d'une centrifugation à 12 000 tr/min pendant 5 min. La phase organique a été utilisée pour la détection. Des échantillons pour la dégradation du PET ont été préparés en ajoutant 20 % de diméthylsulfoxyde (DMSO), suivi de l'extraction telle qu'utilisée pour les échantillons de CP et de HBCD. La concentration et les métabolites intermédiaires de CP ont été détectés par détection par chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS) (Agilent & GC-7890B; MS-5977B). La phase organique a été incubée avec un volume égal de BSTFA à 70 °C pendant 30 min avant l'injection44.

Les HBCD ont été quantifiés par chromatographie liquide ultra-performante-spectrométrie de masse à temps de vol quadripolaire (UPLC-TOF/MS) équipée d'une colonne analytique Eclipse XDB C18 (5 μm, 4,6 × 150 μm, Keystone Scientific, Agilent). Une phase mobile d'eau et de méthanol à un débit de 0,25 mL/min a été appliquée pour les composés cibles. Le gradient proportionnel de la phase mobile a commencé à 95 % de méthanol et a augmenté linéairement jusqu'à 100 % en 25 min, puis a diminué immédiatement jusqu'à 95 % et maintenu pendant 10 min. Pour l'analyse par spectrométrie de masse, la source d'ionisation a fonctionné en mode négatif et la détection MS a été réglée de m/z 0 à 1 700. Tous les composés cibles ont été extraits sur la base de leurs ions d'addition d'hydrogène [M + H]- à m/z et de la caractérisation de l'isotope du brome.

L'acide bis-(2-hydroxyéthyl) téréphtalique (BHET) et l'acide mono-(2-hydroxyéthyl) téréphtalique (MHET) ont été quantifiés par chromatographie liquide à ultra-performance (HPLC) équipée d'une colonne analytique Eclipse XDB C18 (5 μm, 4,6 × 150 μm, Keystone Scientific, Agilent). Une phase mobile d'eau avec 0,1 % d'acide formique et de méthanol à un débit de 0,8 mL/min a été appliquée pour les composés cibles. Le gradient proportionnel de la phase mobile a été démarré à 5 % de méthanol et augmenté linéairement à 44 % en 12 min, puis augmenté linéairement à 70 % en 3 min et maintenu pendant 3 min supplémentaires avant de revenir immédiatement à 5 % de méthanol.

La morphologie de la chitine bio-ancrée a été observée et analysée au microscope électronique à balayage (SEM) S3400II (Hitachi, Japon) avec une tension d'accélération de 20 kV. Après avoir été recouverts d'or, tous les échantillons ont été collés sur la plaque d'échantillon SEM et observés séparément. Les changements dans l'apparence des surfaces des membranes PET ont été mesurés à l'aide d'un microscope à force atomique (AFM) (NANOCUTE II, Seiko Instruments Inc.), avec une taille moyenne de 10 nm. Les échantillons de PET ont été lavés trois fois avec de l'eau distillée, puis lavés deux fois avec de l'éthanol.

Tous les tests ont été effectués en double et répétés dans au moins trois expériences indépendantes. Les courbes de concentration-dégradation ont été générées avec le logiciel GraphPad Prism 8.0.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Toutes les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles dans l'article et son fichier d'informations supplémentaires (Fig. 1 supplémentaire et tableaux supplémentaires 1 à 3). Des informations supplémentaires, des données pertinentes et des matériaux biologiques uniques seront disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Ce travail a été soutenu par une subvention (2021YFA0909500) du National Key R&D Program of China, par la subvention (32030004) de la National Natural Science Foundation of China, par la subvention (20XD1421900) du Shanghai Excellent Academic Leaders Program et par la subvention (17SG09) du programme Shuguang de la Shanghai Education Development Foundation et de la Shanghai Municipal Education Commission.

State Key Laboratory of Microbial Metabolism et School of Life Sciences & Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, République populaire de Chine

Ling Huang, Jun Ni, Ping Xu et Hongzhi Tang

CAS Key Laboratory of Quantitative Engineering Biology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Synthetic Genomics et Shenzhen Key Laboratory of Synthetic Genomics, Shenzhen Institute of Synthetic Biology, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, Shenzhen, République populaire de Chine

Chao Zhong et Junbiao Dai

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LH et HT ont conçu et conçu des expériences. LH a réalisé des expériences. HT et PX ont reçu des projets et ont fourni des réactifs et du matériel. LH et HT ont rédigé l'article. LH, JN, HT, CZ, JD et PX ont discuté et révisé le manuscrit. Tous les auteurs ont commenté le manuscrit avant sa soumission. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance avec Jun Ni ou Hongzhi Tang.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Hendrik Ballerstedt et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteur en chef de la gestion principale : Gene Chong. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

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Réimpressions et autorisations

Huang , L. , Ni , J. , Zhong , C. et al. Mise en place d'une plateforme de bioremédiation induite par le sel à partir de Vibrio natriegens marins. Commun Biol 5, 1352 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04319-3

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Reçu : 20 juin 2022

Accepté : 29 novembre 2022

Publié: 09 décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04319-3

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