Régions du virus de l'hépatite C E2 requises pour l'association membranaire

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 433 (2023) Citer cet article

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Le virus de l'hépatite C (VHC) utilise un mécanisme d'entrée hybride. Les données structurelles actuelles suggèrent que lors d'une exposition à un pH bas et au cluster de différenciation 81 (CD81), l'extrémité amino-terminale de la glycoprotéine d'enveloppe E2 devient ordonnée et libère une boucle interne avec deux résidus aromatiques invariants dans la membrane hôte. Ici, nous présentons la structure d'un E2 amino-terminal tronqué avec la boucle de liaison à la membrane dans une conformation courbée et les chaînes latérales aromatiques séquestrées. La comparaison avec trois structures E2 précédemment rapportées avec le même Fab indique que cette boucle interne est flexible et que le contexte local influence l'exposition des résidus hydrophobes. Les tests biochimiques montrent que l'E2 tronqué en amino-terminal n'a pas la capacité de liaison à la membrane de base de l'ectodomaine E2. Ainsi, la région amino-terminale est un déterminant critique à la fois pour CD81 et l'interaction membranaire. Ces résultats fournissent de nouvelles informations sur le mécanisme d'entrée du VHC.

Hepatitis C virus (HCV) is a leading cause of chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma with significant morbidity and mortality rates in humans1. The World Health Organization estimates that there are 1.5 million new HCV infections each year and 58 million people worldwide are chronically infected (2021)." href="/articles/s41467-023-36183-y#ref-CR2" id="ref-link-section-d85794354e485">2. In the United States, annual acute HCV infections increased by 387% from 2010 to 2019 in association with rising addiction to intravenously administered opioids (2019)." href="/articles/s41467-023-36183-y#ref-CR3" id="ref-link-section-d85794354e489"> 3. Les médicaments antiviraux à action directe récemment approuvés sont très efficaces contre tous les génotypes du VHC4, mais une fois guéris, une personne peut être réinfectée. Dans le contexte de la toxicomanie et de l'usage de drogues par voie intraveineuse, la protection durable contre l'infection par le VHC est un besoin médical non satisfait.

Le cluster de différenciation 81 (CD81)5, le récepteur piégeur de classe B de type I (SR-BI)6, la claudine-1 (CLDN)7 et l'occludine (OCLN)8 sont des facteurs cellulaires nécessaires à l'entrée du VHC. Le blocage de la liaison du VHC au CD81 est le principal moyen de neutralisation médiée par les anticorps9. CD81 est exprimé de manière ubiquitaire sur une variété de lignées cellulaires, suggérant un rôle secondaire à la liaison aux récepteurs spécifiques des hépatocytes10,11. CD81 est une protéine membranaire intégrale avec quatre hélices transmembranaires et deux boucles extracellulaires, désignées par la petite et la grande boucle extracellulaire (SEL et LEL, respectivement). Un traitement à faible pH n'inactive pas le HCV12. L'incubation avec CD81-LEL et un pH bas crée un changement conformationnel du VHC qui diminue de manière irréversible la capacité du virus à pénétrer dans les cellules permissives13. Le prétraitement avec un tampon à faible pH ou CD81-LEL augmente l'infectivité du VHC, indiquant que chacune de ces conditions représente une étape d'amorçage nécessaire13.

Alors que les glycoprotéines d'enveloppe du VHC 1 et 2 (E1 et E2) assurent la liaison et l'entrée des récepteurs, E2 interagit spécifiquement avec CD81 et SR-BI5,6. E2 est une protéine membranaire de type I avec une glycoprotéine soluble amino (N) terminale et une hélice transmembranaire (TM) carboxy (C) terminale (Fig. 1a). A noter que la numérotation est basée sur la séquence J6 (génotype 2a), étudiée ici, et varie légèrement selon les génotypes. Le noyau E2 central est un domaine globulaire plié qui comprend un sandwich d'immunoglobuline stabilisé au disulfure flanqué de la région hypervariable 1 (HVR1), du site antigénique (AS) 412, de la couche avant et de HVR2 sur l'extrémité N-terminale et une région de tige sur l'extrémité C-terminale14 (Fig. 1a). L'architecture globale de l'E2core (résidus 460 à 646) comprend une feuille centrale d'immunoglobine β-sandwich (résidus 485 à 519) suivie d'une boucle de liaison à CD81 (résidus 520 à 539) et d'une courte feuille à β sandwich (résidus 540 à 570). L'E2core conserve l'architecture globale E2 de l'ectodomaine mais est incapable de se lier au CD8115.

a Représentation schématique de E2 pleine longueur (isolat J6, génotype 2a) et de divers fragments utilisés dans les études structurelles et fonctionnelles. b Structure cristalline aux rayons X de E2core + tige (PDB ID : 8DK6). Le modèle final se compose des résidus 491–571 et 596–653 de E2core + tige (c) La structure E2core (PDB ID: 4WEB) se compose des résidus 488–522, 538–571 et 596–649. d La structure eE2 (PDB ID : 7MWW) se compose des résidus 422–453, 490–571 et 596–650, et e le ΔHVR1 eE2/tCD81-LEL (PDB ID : 7MWX) se compose des résidus 418–453, 490–571 et 597–650. Chaque structure (b – e) a été déterminée en présence d'anticorps Fab 2A12 non neutralisant (non illustré). Les résidus de chaîne lourde et de chaîne légère Fab 2A12 sont constitués des résidus 1–219 et 1–218, respectivement. La région de la boucle de liaison CD81 (520–539) est codée par couleur selon un pour E2core + tige, E2core, eE2, ΔHVR1 eE2/tCD81-LEL et couche avant avec rouge, cyan, bleu, vert et blé, respectivement. Les résidus Tyr529, Trp531 à l'extrémité de la boucle de liaison au CD81 et Ile422 de la couche avant sont également mis en évidence. Les régions désordonnées sont représentées par une ligne pointillée. L'orientation E2 en b–e est approximativement la même. La numérotation des résidus pour chaque chaîne construite dans les modèles structuraux finaux est donnée.

Récemment, les structures de E2 en présence et en l'absence de tamarin hôte non productif CD81-LEL (tCD81-LEL) à faible pH ont été rapportées16. En l'absence de CD81, l'ectodomaine de E2 (eE2) a une boucle interne (la boucle de liaison CD81) collée contre Ile422 de la couche avant. Lors de la liaison à CD81 à faible pH, eE2 subit deux changements conformationnels : la couche avant interagit avec CD81 en repliant AS412 autour de CD81, et la boucle de liaison à CD81 s'éloigne du noyau. La boucle de liaison au CD81 présente deux résidus hydrophobes invariants (Tyr529 et Trp531) à l'extrémité de la boucle, qui sont essentiels pour l'interaction avec la membrane hôte16.

Ici, nous caractérisons le rôle de la couche avant et de la tige sur CD81-LEL et la liaison membranaire. La chromatographie d'exclusion de taille et un test de flottation des liposomes ont démontré que la couche frontale E2 est une région critique pour l'interaction CD81-LEL et membranaire. La structure cristalline aux rayons X de la tige E2core +, dépourvue des régions HVR1, AS412, couche avant et TM (Fig. 1a), en présence d'un anticorps non neutralisant, 2A12, a été déterminée. Dans la structure, la région de la tige est désordonnée tandis que la boucle de liaison au CD81 est dans une conformation courbée, séquestrant les résidus Tyr529 et Trp531 au centre de la boucle. L'extension de la boucle de liaison au CD81 peut être plus nuancée qu'on ne le pensait auparavant et sa flexibilité joue probablement un rôle important dans l'entrée et la fusion virales.

Toutes les structures précédentes de HCV E2 déterminées par cristallographie aux rayons X omettaient la tige (646–712) et les régions d'ancrage TM (713–746) pour augmenter la solubilité et la stabilité des protéines pour la formation de cristaux15,16,17,18,19,20. Pour comprendre le rôle structurel de la région souche, des essais de cristallisation ont été réalisés sur divers fragments E2 en présence et en l'absence du Fab 2A12. Les cristaux du fragment E2core + tige (456–713) lié au Fab 2A12 ont été déterminés à une résolution d'environ 2, 5 Å (tableau 1). Le modèle final comprend les résidus 491–571 et 596–653 de E2core + tige ainsi que les résidus de chaîne lourde 1–219 et les résidus de chaîne légère 1–218 de 2A12 Fab. L'alignement de la structure E2core + tige avec E2core, eE2 et le complexe ∆HVR1 eE2/tCD81-LEL a donné un écart quadratique moyen (RMSD) de 0,49 Å, 0,46 Å et 0,80 Å, respectivement pour des positions carbone alpha similaires (Fig. 1)15,16. La structure E2core + tige n'avait pas de densité interprétable pour la majeure partie de la région de la tige (résidus 653–713). Dans la structure E1E2 récente, la région tige est en complexe avec E1, ce qui suggère que le repliement de cette région peut être dépendant de E121. La structure E2core + tige montre une densité électronique continue pour la boucle de liaison CD81 (résidus 520–539) (Fig. 2 supplémentaire), qui est distincte des structures précédemment rapportées (Fig. 1) et stabilisée par un garnissage cristallin (Fig. 2).

a L'unité asymétrique du complexe E2core + tige/2A12 Fab est représentée. b Le tassement cristallin du complexe E2core+stem/2A12 Fab, met en évidence une symétrie mate autour d'un double axe de rotation dans la page (ellipse noire). La boucle de liaison CD81 (rouge) est emballée contre un compagnon de symétrie, maintenant la boucle dans la conformation courbée. HC et LC désignent respectivement la chaîne lourde et la chaîne légère du Fab 2A12.

La structure E2core + tige représente la quatrième structure d'un fragment E2 de l'isolat J6 du VHC lié au chaperon de cristallisation 2A12 Fab15,16 (Fig. 1). En conséquence, la comparaison de structures de différentes longueurs E2 du même génotype en présence ou en l'absence de tCD81-LEL dévoile des détails mécanistes importants. La principale différence structurelle entre les quatre structures E2 est l'orientation de la boucle de liaison CD81 (Fig. 1b – e). La suppression de la boucle de liaison CD81 du calcul de superposition a abaissé la RMSD à moins de 0,3 Å pour des atomes de carbone alpha similaires ; par conséquent, la présence de la couche avant, HVR1, et de la tige n'a aucun effet sur le pli globulaire de la région centrale E2. La boucle de liaison CD81 dans la structure E2core + tige est courbée vers la couche arrière de E2 (Figs. 1b et 3a).

a Bent (E2core + tige, ID PDB : 8DK6), b rétracté (eE2) (ID PDB : 7MWW) et c étendu (ΔHVR1 eE2) (ID PDB : 7MWX) dans trois orientations différentes. Pour plus de clarté, Y529, W531 et I422 sont mis en surbrillance et le tCD81-LEL lié à c n'est pas représenté.

Pour mieux comprendre l'étendue du mouvement de la boucle de liaison au CD81, la boucle a été comparée à la région correspondante des autres structures E2. La suppression de HVR1, AS412 et de la couche avant dans la structure E2core (PDB ID 4WEB) a entraîné le désordre de la boucle de liaison CD81 (Fig. 1c)15. Dans la structure eE2, sans CD81, la couche avant et plus particulièrement le résidu Ile422 oriente la boucle de liaison au CD81 en position rétractée (Figs. 1d et 3b). En présence d'un pH bas et de tCD81-LEL, la région AS412 de ΔHVR1 eE2 devient ordonnée et le résidu Ile422 se déplace d'environ 9 Å, coïncidant avec une boucle de liaison CD81 étendue (Figs. 1e et 3c). La distance entre les résidus de boucle de liaison à CD81, Tyr529 ou Trp531, dans E2core + tige (courbée) et eE2, contenant la couche avant, en l'absence de CD81-LEL (rétractée) est d'environ 17 Å et d'environ 19 Å, respectivement (Fig. 4a). La comparaison de la boucle de liaison CD81 étendue de ΔHVR1 eE2, du complexe avec tCD81-LEL, avec la tige courbée E2core + a démontré un mouvement de distance d'environ 30 Å et d'environ 22 Å de Tyr529 et Trp531, respectivement (Fig. 4b). De plus, l'orientation de la boucle est coudée dans le sens opposé par rapport à CD81. Pour référence, le mouvement de la boucle de liaison CD81 en l'absence et en présence de tCD81-LEL est fourni (Fig. 4c).

La superposition de a la boucle de liaison au CD81 courbée de E2core+stem (rouge) avec la boucle de liaison au CD81 rétractée de eE2 (bleu), b la boucle de liaison au CD81 étendue de ΔHVR1 eE2 (vert) et la boucle de liaison au CD81 courbée de E2core+stem (rouge), et c la boucle de liaison au CD81 étendue de ΔHVR1 eE2 (vert) et le CD81- rétracté boucle de liaison de eE2 (bleu). b, c tCD81-LEL lié à ΔHVR1 eE2 (vert) n'est pas représenté. Les résidus de squelette adjacents sont gris. L'emplacement des chaînes latérales Y529 et W531 est représenté par des bâtonnets d'hétéroatomes et les distances sont fournies.

Étant donné que la boucle de liaison au CD81 était présente dans chacune des quatre constructions utilisées dans la détermination de la structure, mais adopte des conformations distinctes en même temps que les modifications de la couche AS412/avant et de la région de la tige, nous avons émis l'hypothèse que ces différences régulent la liaison au CD81. E2core, seul, ne parvient pas à se lier au CD81-LEL humain (hCD81-LEL) tandis que eE2 se lie au hCD81-LEL avec une affinité inférieure à celle du tCD81-LEL15. Nous avons donc sondé si la région souche E2 pouvait affecter la liaison hCD81-LEL. La tige E2core + a été incubée avec hCD81-LEL humain à faible pH et ensuite analysée par chromatographie d'exclusion stérique (SEC). Un tampon à faible pH a été utilisé puisque l'affinité E2 pour hCD81-LEL est augmentée en présence d'un faible pH16. L'ajout de la tige au E2core n'a pas permis de lier hCD81-LEL en présence ou en l'absence de 2A12 Fab (Fig. 1 supplémentaire). Ces résultats identifient la couche avant comme un déterminant critique pour les interactions CD81-LEL, conformément à la récente structure eE2/tCD81-LEL16.

Le VHC eE2 présente une liaison membranaire de base qui est augmentée à la fois par l'acidification et l'interaction CD81 et éliminée par la mutation de Ile422, Tyr529 ou Trp53113,16. L'un ou l'autre des deux modèles pourrait expliquer l'interaction entre la région N-terminale de E2 et la boucle de liaison au CD81 pour l'insertion de la membrane (Fig. 5). Si l'extension de la boucle de liaison au CD81 est nécessaire et suffisante pour la liaison à la membrane, la suppression de la région N-terminale régulatrice libérera la boucle de liaison au CD81, ce qui donnera une protéine E2 qui se lie efficacement aux membranes en l'absence de CD81. En variante, si la région N-terminale aide à présenter la boucle de liaison au CD81 d'une manière plus propice à l'insertion membranaire, la suppression de la région N-terminale entraînera une protéine E2 incapable de se lier aux membranes. Un test de flottation des liposomes a été utilisé pour évaluer l'effet de la couche avant et de la tige de E2 sur la liaison membranaire. En bref, eE2, eE2 + tige (Fig. 1a) ou E2core + tige ont été incubés avec des liposomes en présence ou en l'absence de tCD81-LEL à pH 5, 0, séparés dans un gradient de saccharose et détectés par Western blot avec un anticorps spécifique à E2core (Fig. 6, Fig. 3 supplémentaire). tCD81-LEL a été utilisé dans le test de flottation car le tamarin CD81 supporte l'infection par le VHC et se lie à E2 avec une affinité plus élevée16,22,23. Les protéines libres restent au bas du gradient de saccharose, tandis que les protéines liées aux liposomes migrent vers le haut du gradient. eE2 montre une association spectaculaire de liposomes à faible pH en présence de tCD81-LEL, tandis que l'ajout de la région de la tige (eE2 + tige) a une augmentation plus modeste du signal avec l'ajout de tCD81-LEL. Cela pourrait être dû au fait que la région souche (60 résidus) est désordonnée en l'absence de E1, qui inhibe l'association membranaire. Inversement, la tige E2core + n'a pas montré d'association membranaire et de flottation à faible pH indépendamment de la présence de tCD81-LEL. Une flottation de liposomes réalisée sur eE2 avec ou sans HVR1 a montré une liaison équivalente aux liposomes à faible pH en l'absence et en présence de tCD81-LEL. Ainsi, HVR1 a un effet négligeable sur la capacité de E2 à interagir avec la membrane (Fig. 4 supplémentaire). Les résultats des essais de flottation des liposomes (Fig. 6 et Fig. 4 supplémentaire) soulignent le rôle important que joue la couche avant dans l'organisation de la boucle de liaison au CD81 pour l'association membranaire. La flottation de eE2 est cohérente avec les découvertes précédentes selon lesquelles la substitution par l'alanine de Ile422 de la couche avant (qui jouxte le Tyr529 sous la forme rétractée de la boucle de liaison CD81) échoue à l'association membranaire16. Dans la structure E2core + tige, la boucle de liaison au CD81 est courbée dans la direction opposée avec Tyr529 et Trp531 séquestrés dans la boucle (Fig. 2 supplémentaire). En résumé, la couche avant de E2, le récepteur CD81 et un pH bas sont tous des exigences intégrales pour présenter correctement la boucle de liaison CD81 pour la liaison membranaire.

a La structure CD81 humaine pleine longueur (diagramme en ruban avec les hélices transmembranaires colorées en jaune) et la molécule de cholestérol coordonnée (bâtonnets d'hétéroatomes vert clair) (ID PDB : 5TCX) ont été ancrées dans une bicouche membranaire idéalisée de palmitoyloléoylphosphatidylcholine (POPC)44. Des plans parallèles de sphères grises représentent les fractions carbonyle qui définissent le noyau hydrophobe de la bicouche membranaire, et des phospholipides représentatifs sont ancrés dans la bicouche et représentés sous forme de bâtonnets d'hétéroatomes cyan. Les diagrammes en ruban de CD81-LEL (bleu ciel) et de la boucle de liaison CD81 des structures étendues (ΔHVR1 eE2) et courbées (E2core + tige) sont représentés en vert et en rouge, respectivement. b Le panneau est un grossissement de la boucle de liaison au CD81 et une partie de la membrane montrant les distances relatives (lignes pointillées) de Tyr529 et Trp531 par rapport au noyau de la membrane hydrophobe sont étiquetées.

a Western blots des fractions supérieure, médiane et inférieure de l'essai de flottation des liposomes. Le marqueur de poids moléculaire protéique et le marqueur de contrôle de chargement eE2 sont marqués respectivement L et M. Le test de flottation a été réalisé dans trois expériences indépendantes, et un test est présenté. Chaque expérience a montré la même tendance; c'est-à-dire, aucune flottation de E2core+stem avec et sans tCD81-LEL à pH bas tandis qu'une augmentation marquée du signal en présence de tCD81-LEL pour eE2 et moins d'amélioration avec eE2+stem. Pour les données de source de gel, voir Fig. 3 supplémentaire. b Quantification de la fraction supérieure Western blot avec des unités arbitraires.

Nous décrivons ici les régions de VHC E2 nécessaires pour la liaison de CD81 et la régulation de la boucle de liaison de CD81 pour l'association membranaire, ce qui donne des informations uniques et mécanistes sur l'entrée du VHC. Bien que la boucle de liaison CD81 de E2 soit impliquée dans la liaison membranaire, la boucle est nécessaire mais insuffisante pour la liaison membranaire. La région N-terminale qui jouxte la boucle de liaison CD81 sous la forme non liée est également nécessaire pour la liaison membranaire. Cette région N-terminale, y compris l'AS412 et la couche avant, forme le site de liaison CD81, qui est le site principal de la neutralisation médiée par les anticorps impactant la liaison membranaire via Ile422. Nous en déduisons donc que ce mécanisme est finement réglé plutôt qu'une simple somme de ses parties.

Nous montrons ici la structure du fragment E2core + tige lié au Fab 2A12 non neutralisant déterminé à une résolution de 2, 5 Å. Les structures du complexe E2core + tige, E2core, eE2 et ΔHVR1 eE2 / tCD81-LEL présentent des informations mécanistes uniques au cours des premiers stades de l'infection et fournissent un modèle pour les changements qui se produisent lors de la liaison au récepteur et de l'acidification endosomale (Fig. 6). La région E2core contient le domaine globulaire replié. L'AS412 et la couche avant sont les déterminants essentiels du bon positionnement de la boucle de liaison CD81 et de l'interaction CD81. En l'absence de CD81, Ile422 de la couche avant maintient la boucle de liaison de CD81 en position rétractée. La tige E2core et E2core + n'a pas réussi à se lier à hCD81 in vitro, démontrant l'importance de la région N-terminale (384-459) dans la liaison au récepteur. Le VHC, comme le virus de la leucose du sarcome aviaire (ASLV), utilise une méthode hybride de fixation membranaire, qui nécessite un récepteur cellulaire et un faible pH24. Dans ces conditions, E2 subit deux changements conformationnels : la couche avant interagit avec CD81, repliant la région AS412 autour de CD81, et une boucle interne (boucle de liaison à CD81) s'étire alors à l'écart du noyau (Fig. 7a). Deux résidus hydrophobes invariants (Tyr529 et Trp531) à l'extrémité de la boucle de liaison au CD81 sont étendus vers l'hôte et insérés dans la membrane. La suppression de la couche avant E2 supprime l'interaction CD81 et libère la boucle de liaison CD81 (Fig. 7b). Cependant, la tige E2core + était incapable de se lier à la membrane, ce qui suggère que la boucle de liaison au CD81 seule est insuffisante pour la liaison à la membrane et nécessite la couche avant pour une orientation correcte (Fig. 6). Au total, ces quatre structures fournissent une image mécaniste de la flexibilité de la boucle de liaison au CD81, de la fonction régulatrice de la région N-terminale et d'une compréhension détaillée du processus d'entrée virale.

a En présence de CD81 et de pH bas, la couche avant s'enroule autour de CD81, puis la boucle de liaison de CD81 s'étend vers la membrane hôte. b La suppression de la couche avant d'E2 entraîne la libération de la boucle de liaison au CD81, qui ne parvient pas à se lier au CD81 même à faible pH et perd la capacité d'interagir avec les membranes.

Tous les virus d'enveloppe interagissent et fusionnent avec les membranes cellulaires pour délivrer le génome viral dans la cellule. Modélisation du complexe E2/tCD81-LEL sur la structure pleine longueur de CD81 (PDB ID : 5TCX25) Tyr529 et Trp531 sont situés à l'extrémité de la boucle de liaison de CD81 qui s'étend vers la bicouche (Fig. 5). Ces résidus sont invariants par tous les principaux génotypes et sont nécessaires pour la liaison au CD81 et l'entrée virale26,27. La superposition de la structure E2core + tige sur le complexe eE2 / CD81 pleine longueur éloigne le Tyr529 et le Trp531 du feuillet externe de la membrane à des distances supérieures à 35 Å et 31 Å d'une couche de phosphatidyl carbonyle idéalisée, respectivement (Fig. 5). La région N-terminale de E2 peut aider à orienter la boucle de liaison CD81 vers la membrane. Le modèle de la Fig. 5 utilise une bicouche idéalisée. Cependant, la flexibilité de la boucle de liaison CD81 peut être avantageuse lors d'une infection par le VHC où la courbure de la membrane hôte dans l'endosome et la présence d'autres facteurs (c'est-à-dire E1, OCLN et/ou CLDN) peuvent nécessiter une flexibilité de la boucle pour l'insertion de la membrane.

Les protéines de fusion membranaire virale sont organisées en trois classes (I, II et III) basées sur des critères structuraux avec quatre mécanismes de déclenchement de fusion24. Actuellement, la protéine de fusion du VHC n'a pas été identifiée de manière concluante, et encore moins classée. Il est proposé que la glycoprotéine E1 du VHC soit la sous-unité fusogénique de l'hétérodimère E1E2 car elle contient un peptide de fusion putatif28,29. Cependant, la boucle de liaison à CD81 de E2 a des propriétés de liaison à la membrane et E2 contient un repliement en sandwich bêta de type IgG similaire aux protéines de fusion de type II24,30. Pour compliquer davantage la classification, E1 et E2 sont nécessaires pour une fusion virus/hôte efficace, une caractéristique qui n'est attribuée à aucune classe. Très probablement, la boucle de liaison CD81 est intégrée dans la membrane cible et aide au processus de fusion. Toutes les protéines virales fusogènes sont trimériques, cependant, aucune preuve d'un trimère E2 n'a été trouvée, bien que l'hélice TM ou E1 puisse avoir un impact sur l'oligomérisation. La structure cryoEM de la glycoprotéine E1E2 en complexe avec trois Fab neutralisants a été récemment publiée21, qui contient une seule copie de l'hétérodimère E1E2. De même, l'inclusion de la tige n'a pas produit de trimères dans la structure de la tige eE2+, bien que cela puisse être dû au Fab 2A12, qui interagit à l'extrémité carboxyle de la protéine E2. Une étude plus approfondie est justifiée pour mieux comprendre le processus de fusion du VHC.

Il a été démontré que SR-BI et CD81 interagissent directement avec E2 après l'attachement initial à la cellule sensible. SR-BI se lie via le HVR1 N-terminal, tandis que CD81 se lie à la protéine E2 via une région discontinue qui comprend AS412, AS432, la boucle de liaison à CD81 et la couche arrière6,16. Cependant, le mécanisme moléculaire de l'interaction SR-BI avec E2 reste obscur. CD81 avec un déclencheur de pH bas peut être suffisant pour induire des changements conformationnels. Il est possible que le SR-BI soit efficace pour induire des changements conformationnels d'une manière dépendante de l'isolat du VHC31,32.

L'utilisation du récepteur secondaire, CD81, pour la fusion est avantageuse pour le virus et conforme aux observations précédentes13. Alors que E2 et CD81-LEL forment un complexe à pH neutre et peuvent le faire à la surface cellulaire, la stabilité et l'homogénéité du complexe augmentent à faible pH, ce qui est compatible avec l'acidification endosomale. tCD81-LEL adopte une conformation ouverte dans laquelle l'hélice D est déroulée, tandis que le CD81 humain a été observé le plus souvent dans la conformation fermée, des conformations intermédiaires et ouvertes ont également été décrites33. La structure E2/tCD81-LEL n'est qu'un instantané du complexe après acidification et avant tout changement conformationnel induit par la fusion. Comme pour la description d'autres protéines de fusion virale, des études structurelles et mécanistes supplémentaires sont nécessaires pour décrire de manière adéquate le mécanisme de fusion du VHC.

Les HVR de E2 comprennent une proportion importante de variants de séquence du VHC. Ces régions sont un mode de neutralisation de l'évasion des anticorps. Chez les patients, le HVR1 change rapidement en raison de la dérive antigénique induite par les anticorps. Les anticorps largement neutralisants sont dirigés contre les épitopes conformationnels conservés de l'E2 du VHC qui entrent en compétition avec le site de liaison au CD81. La boucle de liaison au CD81 est exposée en surface et est protégée de la neutralisation médiée par les anticorps par obscurcissement conformationnel. L'identification de la boucle de liaison au CD81 dans l'insertion membranaire fournit une cible pour la conception d'un vaccin contre le VHC. La conservation relativement élevée de la séquence de la boucle de liaison au CD81 parmi différents génotypes du VHC et l'observation que les boucles de liaison à la membrane d'autres virus, notamment le VIH34, Ebola35,36,37, la grippe38 et la dengue39, sont des cibles majeures pour les vaccins et les anticorps neutralisants suggèrent que la boucle de liaison au CD81 du VHC pourrait être une cible thérapeutique potentielle. Les informations obtenues à partir de ces structures cristallines atomiques pourraient être utiles dans le développement de conceptions de vaccins prophylactiques contre le VHC.

Les fragments E2 de l'isolat J6 du VHC (E2core + résidus souches 456–713, eE2 + résidus souches 384–713 et eE2 résidus 384–656) et CD81-LEL (résidus 112–202 humains et tamarins) ont été exprimés dans des cellules HEK293T GnTI(–) (ATCC, CRL-3022) et purifiées comme décrit précédemment40. En bref, un vecteur lentiviral contient un promoteur CMV, une séquence signal de la prolactine, un fragment J6 E2 comme indiqué ci-dessus et un site de clivage HRV3C suivi de la protéine A C-terminale et des étiquettes Flag. Les cellules HEK293T GnTI(–) exprimant stables ont été produites par transduction lentivirale. Les cellules ont ensuite été cultivées dans un bioréacteur à cellules adhérentes (Cesco Bioengineering) pour une croissance à long terme et une production de protéines. Le milieu surnageant a été recueilli tous les 2 jours et purifié par chromatographie d'affinité IgG suivie d'une digestion en colonne avec la protéase HRV3C. La protéine a été purifiée à haute qualité par chromatographie soustractive sur des colonnes GST et Q suivie d'une chromatographie d'exclusion de taille avec une colonne Superdex200 (Cytiva Life Sciences). Le rendement final de chaque protéine était d'environ 5 à 10 mg/L de surnageant.

Le protocole a été adapté d'une étude précédente16. En bref, la lignée cellulaire d'hybridome 2A12 de souris a été cultivée dans le flacon bioréacteur CELLine Classic (Sigma-Aldrich). 6 ml de 6 × 106 cellules dans le milieu de Dulbecco modifié d'Iscove (IMDM) avec 15% de FBS à faible teneur en IgG et 10 mM HEPES pH 7, 5 (milieu de culture) ont été inoculés dans la couche interne du flacon. La membrane supérieure a été complétée par 350 ml d'IMDM avec 1% de FBS à faible teneur en IgG et HEPES 10 mM pH 7, 5 (milieu nutritif). Une fois que la confluence cellulaire a atteint 6 × 108, le milieu de culture a été collecté et centrifugé à 1000 tr/min pendant 20 min. Le milieu 2A12 surnageant a ensuite été purifié à travers la colonne de protéine G. Avant la digestion à la papaïne pour produire le Fab 2A12, l'anticorps 2A12 purifié a été dialysé dans du phosphate de sodium 20 mM pH 7,0 et de l'EDTA 10 mM, et de la cystéine-HCl a été ajoutée à une concentration finale de 20 mM et le pH a été ajusté à 7,0. Environ 100 μL de papaïne en billes de gélose immobilisée (Thermo Fisher Scientific) ont été utilisés pour 20 mg d'anticorps 2A12 et une digestion à 100% a été obtenue par incubation à 22 ° C pendant la nuit par inversion douce. La réaction de digestion a été arrêtée en éliminant la papaïne immobilisée par centrifugation à 4200 × g à 4 ° C pendant 20 min. Le Fab 2A12 purifié a été obtenu par une purification en deux étapes par une colonne de protéine A et une colonne de protéine G. HEPES 20 mM pH 7,5, NaCl 250 mM et 5% de glycérol ont été utilisés dans la purification tandis que pour la colonne de protéine G liée 2A12 Fab a été éluée par 0,05% TFA qui a été immédiatement neutralisé par 1 M Tris pH 8,0. Le Fab 2A12 a été dessalé dans Tris 20 mM pH 8,0 pour une utilisation ultérieure et un stockage à long terme.

E2core + tige (résidus 456–713) a été reconstitué avec 2A12 Fab dans un rapport molaire de 1: 1, 2 (p / p) et hCD81-LEL y a été ajouté dans un rapport molaire de 1: 1, 3. Le complexe a été incubé pendant une nuit à 4°C. Le complexe a été purifié dans du citrate de sodium 20 mM pH 4,5, tampon NaCl 100 mM par chromatographie d'exclusion de taille sur colonne Superdex200 (Cytiva Life Sciences). Le pic principal (Fig. 1 supplémentaire) a été collecté et concentré à travers une unité de filtration ultra centrifuge Amicon de 3 kDa MW (Millipore) jusqu'à une concentration finale de 5 mg/mL. L'analyse des pics de chromatographie d'exclusion stérique montre que hCD81-LEL ne se lie pas au complexe (Fig. 1B supplémentaire). Le complexe E2core + tige / 2A12 Fab a été mis en place à petite échelle, 400 nL, taille de goutte à l'aide d'un système de manipulation de liquide de moustique (SPT Labtech) avec divers écrans de cristallisation (Hampton Research). Des cristaux de qualité diffraction ont été cultivés dans un écran Hampton HR2-139, condition D10; Citrate de sodium tribasique dihydraté 0,2 M, 20 % p/v PEG 3350, pH 8,3. Les cristaux ont été directement congelés à partir de plaques à 96 puits en utilisant 30 % d'éthylène glycol comme cryoprotecteur, et refroidis par flash dans de l'azote liquide. Les données ont été collectées à 0,979 Å sur la ligne de lumière SER-CAT 22-ID à l'APS, Laboratoire National d'Argonne.

Les cristaux E2core + tige (résidus 456–713) −2A12Fab appartiennent au groupe d'espace P22121 avec des paramètres de cellule unitaire a = 48,97 Å, b = 125,54 Å et c = 157,32 Å. Les phases moléculaires ont été déterminées par PHENIX_phaser41 en utilisant l'entrée PDB 7MWW comme modèle de départ. Le placement sans ambiguïté des chaînes lourdes et légères Fab a fourni les phases nécessaires pour étendre la carte afin de couvrir les coordonnées eE2, en utilisant des cycles itératifs de construction de modèles et de modification de densité par Coot42. Au cours de chaque cycle de raffinement itératif, le modèle a été évalué pour divers paramètres de qualité. Le modèle final a été construit à une résolution de 2,45 Å. Le modèle E2core + tige contient les résidus 491–571, 596–653 et 2 N-acétylglucosamines, tandis que les résidus 456–490, 572–595 et 653–713 sont absents en raison de la flexibilité. Le modèle Fab 2A12 se compose des résidus 1–218 et 1–219 pour les chaînes légères et lourdes, respectivement. Le modèle a été affiné à Rwork 0,203 et Rfree 0,231 avec 96,12 % des résidus dans les régions favorisées, 3,53 % autorisées et 0,35 % des régions aberrantes du graphique de Ramachandran calculé à l'aide du logiciel MolProbity43. Le CC1/2 global (coefficient de corrélation de Pearson) des données traitées est de 0,991, et le CC1/2 dans la coque externe est de 0,571. L'exhaustivité globale des données est de 97,8 % avec 99,1 % dans l'enveloppe externe avec la redondance 4 et 4.2, respectivement. Les statistiques de traitement et de raffinement des données sont présentées dans le tableau 1.

Le test de flottation des liposomes a été adapté avec de légères modifications16. 15 μg d'un fragment J6 E2 [eE2core + tige (résidus 456–713), eE2 (résidus 384–656), eE2 + tige (résidus 384–713) ou ΔHVR1 eE2 (406–656)], a été mélangé avec 18 μg CD81-LEL (un excès six fois molaire de CD81 -LEL) et volume ajusté à 60 μL avec 20 mM de citrate de sodium pH 5,0 et 100 mM de NaCl. Les échantillons ont été incubés pendant une nuit à 4°C sur de la glace. 54 μL de PC de soja 200 nm : des liposomes de cholestérol (rapport molaire 70:30) d'Encapsula NanoSciences (stock 10 mM ou 8 μg/μL) (CPC-610) ont été ajoutés et incubés à 37 °C pendant 1 h en tapotant doucement à certains intervalles. Après incubation, 67 μL de KCl 3 M ont été ajoutés à une concentration finale de KCl 1 M et incubés à 37 ° C pendant 15 min pour minimiser l'association électrostatique non spécifique entre les protéines et les lipides. Ensuite, 67 % (p/v) de saccharose dans du citrate de sodium 20 mM pH 5,0 et un tampon NaCl 100 mM ont été ajoutés à une concentration finale de 40 % dans un volume final de 500 μL. L'échantillon a été mélangé doucement avec une pipette de 1 ml, puis déposé sous un gradient étagé de 0,1 ml à 5 % et 11,4 ml de saccharose à 25 % (p/v) dans un tube à centrifuger ultra-transparent à paroi mince à dessus ouvert (Beckman Coulter, 344060). Les gradients ont été centrifugés à 281 000 × g pendant 150 min à 4 ° C dans un rotor à godet oscillant SW40 Ti (Beckman Coulter Optima XL-100K Ultracentrifuge). Après centrifugation, chaque gradient a été fractionné, de haut en bas, en 20 fractions de 600 μL. Les fractions du haut ou du milieu ont ensuite été concentrées dans des unités de filtration centrifuge Amicon Ultra-0,5 ml (Millipore) de 10 kDa MW à une vitesse de 10 000 × g jusqu'à un volume final de 150 μL. 15 μL de colorant réducteur 10 × SDS – PAGE ont été ajoutés à chacun de ces échantillons pour une analyse Western blot.

Toutes les fractions ont été diluées avec un tampon d'échantillon réducteur SDS – PAGE 10 × à une concentration finale de 1 × et dénaturées à 95 ° C pendant 5 min. 50 μL de chaque échantillon ont été analysés avec le marqueur eE2 et un marqueur de poids moléculaire Odyssey Protein (Li-Cor) (L) sur des gels préfabriqués Bis-Tris à 4–20 % (Bio-Rad). Les protéines ont ensuite été transférées sur des membranes PVDF à l'aide d'un système de transfert turbo Trans-Blot (Bio-Rad). La membrane a été bloquée par le tampon de blocage Intercept (PBS) (Li-Cor) pendant 1 h à 37 ° C, suivi de l'incubation du transfert avec une dilution au 1: 500 d'une souris 8A6 purifiée pendant une nuit à 4 ° C. La dilution d'anticorps primaire a été préparée dans du tampon de blocage Odyssey dans du PBS avec 0,05 % de Tween 20 (Sigma-Aldrich). L'anticorps secondaire, IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (Li-Cor, 926-32210), a été utilisé à une dilution de 1:10 000. Le transfert Western a été scanné à l'aide du logiciel Li-Cor Odyssey (v.3.0).

L'anticorps monoclonal 8A6 a été généré dans le laboratoire du Dr Arash Grakoui (numéro de protocole IACUC YER-2002369-070816GN, Emory University School of Medicine, Atlanta, Géorgie, États-Unis). Des souris BALB/c ont été immunisées par voie intrapéritonéale avec 50 μg d'eE2 dans l'adjuvant complet de Freund (première immunisation uniquement) ou dans l'adjuvant incomplet de Freund toutes les deux semaines pendant 8 semaines. Une immunisation finale avec 50 µg d'eE2 a été administrée par voie intraveineuse quatre jours avant le prélèvement des splénocytes. Des hybridomes ont été générés en utilisant une lignée cellulaire de myélome de souris sensible à la HAT clonée comme partenaire de fusion. Les hybridomes proliférants ont été criblés pour leur capacité à se lier à eE2 via ELISA, moment auquel 8A6 a été identifié positivement.

Les cellules d'hybridome ont été multipliées dans IMDM (Hyclone) contenant 10 % de FCS à faible IgG (Hyclone) et de la gentamicine (Gibco). Le surnageant a été récupéré et clarifié par centrifugation à 4000 × g pendant 10 min à 4 °C. Les anticorps monoclonaux ont été purifiés par chromatographie sur colonne d'affinité pour la protéine G et concentrés à l'aide d'unités de filtre centrifuge Amicon Ultra-15 (Millipore).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données à l'appui de cette étude sont disponibles auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable. Les coordonnées et les facteurs de structure générés dans cette étude ont été déposés dans la Protein Data Bank (PDB) sous le code d'accession 8DK6 (E2 core+stem/2A12 Fab). Les structures précédemment publiées utilisées dans cette étude peuvent être trouvées sous les codes d'accession 4WEB (noyau E2), 7MWW (structure eE2), 7MWX (ΔHVR1 eE2/tCD81-LEL) et 5TCX (CD81 pleine longueur).

Axley, P., Ahmed, Z., Ravi, S. & Singal, AK Virus de l'hépatite C et carcinome hépatocellulaire : une revue narrative. J.Clin. Trad. Hépatol. 6, 79–84 (2018).

Article Google Scholar

Rapport d'étape mondial sur le VIH, les hépatites virales et les infections sexuellement transmissibles., (2021).

Rapport de surveillance de l'hépatite virale 2019, (2019).

Baumert, TF, Berg, T., Lim, JK & Nelson, DR Statut de la thérapie antivirale à action directe pour l'infection par le virus de l'hépatite C et défis restants. Gastroentérologie 156, 431–445 (2019).

Article CAS Google Scholar

Pileri, P. et al. Liaison du virus de l'hépatite C au CD81. Sciences 282, 938–941.

Article ADS CAS Google Scholar

Scarselli, E. et al. Le récepteur charognard humain de classe B de type I est un nouveau récepteur candidat pour le virus de l'hépatite C. EMBO J. 21, 5017–5025 (2002).

Article CAS Google Scholar

Evans, MJ et al. Claudin-1 est un co-récepteur du virus de l'hépatite C requis pour une entrée tardive. Nature 446, 801–805 (2007).

Article ADS CAS Google Scholar

Ploss, A. et al. L'occludine humaine est un facteur d'entrée du virus de l'hépatite C nécessaire à l'infection des cellules de souris. Nature 457, 882–6 (2009).

Article ADS CAS Google Scholar

Tzarum, N., Wilson, IA et Law, M. Le visage neutralisant de la glycoprotéine d'enveloppe E2 du virus de l'hépatite C. Devant. Immunol. 9, 1315 (2018).

Article Google Scholar

Feneant, L., Levy, S. & Cocquerel, L. CD81 et infection par le virus de l'hépatite C (VHC). Virus 6, 535–572 (2014).

Article Google Scholar

Gerold, G., Moeller, R. & Pietschmann, T. Entrée du virus de l'hépatite C : interactions protéiques et déterminants de fusion régissant l'invasion productive des hépatocytes. Cold Spring Harb. Perspective. Méd. 10, a036830 (2020).

Article CAS Google Scholar

Tscherne, DM et al. Activation du virus de l'hépatite C en fonction du temps et de la température pour une entrée déclenchée par un pH bas. J. Virol. 80, 1734–1741 (2006).

Article CAS Google Scholar

Sharma, NR et al. Le virus de l'hépatite C est amorcé par la protéine CD81 pour une fusion dépendante du faible pH. J. Biol. Chim. 286, 30361–30376 (2011).

Article CAS Google Scholar

Drummer, HE & Poumbourios, P. La glycoprotéine E2 du virus de l'hépatite C contient une séquence répétée d'heptade proximale à la membrane qui est essentielle pour l'hétérodimérisation de la glycoprotéine E1E2 et l'entrée virale. J. Biol. Chim. 279, 30066–30072 (2004).

Article CAS Google Scholar

Khan, AG et al. Structure de l'ectodomaine central de la glycoprotéine d'enveloppe du virus de l'hépatite C 2. Nature 509, 381–384 (2014).

Article ADS CAS Google Scholar

Kumar, A. et al. Aperçu structurel de la liaison et de l'entrée des récepteurs du virus de l'hépatite C. Nature 598, 521-525 (2021).

Article ADS CAS Google Scholar

Flyak, AI et al. Les anticorps largement neutralisants du VHC utilisent un motif disulfure CDRH3 pour reconnaître un site de glycoprotéine E2 qui peut être ciblé pour la conception de vaccins. Microbe hôte cellulaire 24, 703–716 e703 (2018).

Article CAS Google Scholar

Kong, L. et al. Structure de base de la glycoprotéine de l'enveloppe du virus de l'hépatite C E2. Sciences 342, 1090-1094 (2013).

Article ADS CAS Google Scholar

Flyak, AI et al. Un CDRH2 ultralong dans un anticorps neutralisant le VHC démontre la plasticité structurelle des anticorps contre la glycoprotéine E2. Elife 9, e53169 (2020).

Article CAS Google Scholar

Tzarum, N. et al. Aperçu génétique et structurel de la large neutralisation du virus de l'hépatite C par les anticorps humains VH1-69. Sci. Adv. 5, eaav1882 (2019).

Annonces d'article Google Scholar

Torrents de la Pena, A. et al. Structure du complexe glycoprotéique E1E2 du virus de l'hépatite C. Sciences 378, 263-269 (2022).

Article ADS CAS Google Scholar

Flint, M. et al. Diverses protéines CD81 favorisent l'infection par le virus de l'hépatite C. J. Virol. 80, 11331–11342 (2006).

Article CAS Google Scholar

Allander, T., Forns, X., Emerson, SU, Purcell, RH et Bukh, J. La protéine d'enveloppe E2 du virus de l'hépatite C se lie au CD81 des tamarins. Virologie 277, 358–367 (2000).

Article CAS Google Scholar

White, JM & Whittaker, GR Fusion de virus enveloppés dans des endosomes. Trafic 17, 593–614 (2016).

Article CAS Google Scholar

Zimmerman, B. et al. La structure cristalline d'une tétraspanine humaine pleine longueur révèle une poche de liaison au cholestérol. Cellule 167, 1041–1051 e1011 (2016).

Article CAS Google Scholar

Rothwangl, KB, Manicassamy, B., Uprichard, SL & Rong, L. Dissection du rôle des régions de liaison CD81 putatives de E2 dans la médiation de l'entrée du VHC : la région de liaison CD81 putative 1 n'est pas impliquée dans la liaison CD81. Virole. J. 5, 46 (2008).

Article Google Scholar

Owsianka, AM et al. Identification des résidus conservés dans la glycoprotéine d'enveloppe E2 du virus de l'hépatite C qui sont critiques pour la liaison au CD81. J. Virol. 80, 8695–8704 (2006).

Article CAS Google Scholar

Drummer, HE, Boo, I. & Poumbourios, P. Mutagenèse d'un motif de type peptide de fusion conservé et d'une région de répétition d'heptade proximale à la membrane de la glycoprotéine E1 du virus de l'hépatite C. J. Gen. Virol. 88, 1144-1148 (2007).

Article CAS Google Scholar

Li, HF, Huang, CH, Ai, LS, Chuang, CK & Chen, SS Mutagenèse du domaine de type peptide de fusion de la glycoprotéine E1 du virus de l'hépatite C : implication dans la fusion cellulaire et l'entrée du virus. J. Biomed. Sci. 16, 89 (2009).

Article Google Scholar

Krey, T. et al. Les liaisons disulfure de la glycoprotéine E2 du virus de l'hépatite C révèlent l'organisation tertiaire de la molécule. PLoS Pathog. 6, e1000762 (2010).

Article Google Scholar

Augestad, EH, Bukh, J. & Prentoe, J. Dynamique des protéines d'enveloppe du virus de l'hépatite C et lien avec la région hypervariable 1. Curr. Avis. Virole. 50, 69–75 (2021).

Article CAS Google Scholar

Stejskal, L. et al. Une sécurité entropique contrôle l'entrée du virus de l'hépatite C et la résistance aux anticorps. Elife 11, e71854 (2022).

Article Google Scholar

Cunha, ES et al. Mécanisme de réglage structurel de la grande boucle extracellulaire du récepteur cellulaire humain CD81 du virus de l'hépatite C. Structure 25, 53–65 (2017).

Article CAS Google Scholar

Chuang, GY et al. Développement d'un trimère d'enveloppe stabilisé par 3Mut-Apex qui élargit l'étendue de la neutralisation du VIH-1 lorsqu'il est utilisé pour stimuler les réponses induites par le vaccin dirigé par le peptide de fusion. J. Virol. 94, e00074–20 (2020).

Article CAS Google Scholar

Janus, BM et al. Base structurelle pour une large neutralisation des virus Ebola par un anticorps ciblant la boucle de fusion de la glycoprotéine. Nat. Commun. 9, 3934 (2018).

Annonces d'article Google Scholar

Milligan, JC et al. Caractérisation structurale de l'anticorps pan-ebolavirus 6d6 ciblant le peptide de fusion de la glycoprotéine de surface. J. Infecter. Dis. 219, 415–419 (2019).

Article CAS Google Scholar

Zhao, X. et al. L'anticorps largement protecteur induit par l'immunisation révèle la boucle de fusion du virus Ebola comme un site de vulnérabilité. Cellule 169, 891–904.e815 (2017).

Article CAS Google Scholar

Kallewaard, NL et al. Analyse de la structure et de la fonction d'un anticorps reconnaissant tous les sous-types de la grippe a. Cellule 166, 596–608 (2016).

Article CAS Google Scholar

Costin, JM et al. Etude mécanistique des anticorps monoclonaux humains largement neutralisants contre le virus de la dengue ciblant la boucle de fusion. J. Virol. 87, 52–66 (2013).

Article CAS Google Scholar

Yost, SA, Whidby, J., Khan, AG, Wang, Y. et Marcotrigiano, J. Surmonter les défis de la production de glycoprotéines d'enveloppe du virus de l'hépatite C dans les cellules de mammifères. Méthodes Mol. Biol. 1911, 305-316 (2019).

Article CAS Google Scholar

Adams, PD et al. PHENIX : un système complet basé sur Python pour la solution de structure macromoléculaire. Acta Crystallogr. D. Biol. Cristallologue. 66, 213-221 (2010).

Article CAS Google Scholar

Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, WG & Cowtan, K. Caractéristiques et développement de Foulque. Acta Crystallogr. D. Biol. Cristallologue. 66, 486–501 (2010).

Article CAS Google Scholar

Williams, CJ et al. MolProbity : des données de référence plus nombreuses et de meilleure qualité pour une meilleure validation de la structure de tous les atomes. Protéine Sci. 27, 293–315 (2018).

Article CAS Google Scholar

Lomize, MA, Pogozheva, ID, Joo, H., Mosberg, HI & Lomize, AL Base de données OPM et serveur Web PPM : ressources pour le positionnement des protéines dans les membranes. Nucleic Acids Res. 40, D370–376 (2012).

Article CAS Google Scholar

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Financement en libre accès fourni par les National Institutes of Health (NIH).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Ashish Kumar, Tiana C. Rohe.

Section de virologie structurale, Laboratoire des maladies infectieuses, Institut national des allergies et des maladies infectieuses, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 20892, États-Unis

Ashish Kumar, Tiana C. Rohe, Altaira D. Dearborn et Joseph Marcotrigiano

Emory National Primate Research Center, Division of Microbiology and Immunology, Emory Vaccine Center, Emory University School of Medicine, Atlanta, GA, 30329, États-Unis

Elizabeth J.Elrod & Arash Grakoui

Centre de biotechnologie et de médecine avancées, Rutgers, Université d'État du New Jersey, Piscataway, NJ, 08854, États-Unis

Abdul G. Khan

Direction de la technologie de la recherche, Institut national des allergies et des maladies infectieuses, Instituts nationaux de la santé, Hamilton, MT, 59840, États-Unis

Ryan Kissinger

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AGK a produit la construction souche E2+ et la lignée cellulaire d'expression. AK et TCR ont purifié les protéines et déterminé les conditions de cristallisation. AK et JM ont collecté, traité et analysé les résultats des données de cristallographie aux rayons X. AK et ADD ont conçu, réalisé et analysé les données de flottation membranaire. EJE et AG ont produit l'anticorps 8A6. RK a conçu et produit le modèle. Tous les auteurs ont participé à la rédaction et à la révision du manuscrit.

Correspondance à Joseph Marcotrigiano.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie les évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail.

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Réimpressions et autorisations

Kumar, A., Rohe, TC, Elrod, EJ et al. Régions du virus de l'hépatite C E2 requises pour l'association membranaire. Nat Commun 14, 433 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36183-y

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Reçu : 08 août 2022

Accepté : 19 janvier 2023

Publié: 26 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-36183-y

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