Identification de petites molécules capables d'améliorer la fusion membranaire virale

Virology Journal volume 20, Article number: 99 (2023) Citer cet article

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Plusieurs approches ont été développées pour analyser l'entrée de virus hautement pathogènes. Dans cette étude, nous rapportons la mise en œuvre d'un test de complémentation multicellulaire bimoléculaire (BiMuC) pour surveiller en toute sécurité et efficacement la fusion membranaire médiée par SARS-CoV-2 S sans avoir besoin d'un équipement basé sur la microscopie. À l'aide de BiMuC, nous avons criblé une bibliothèque de médicaments approuvés et identifié des composés qui améliorent la fusion de la membrane cellulaire médiée par la protéine S. Parmi eux, l'éthynylestradiol favorise la croissance du SRAS-CoV-2 et du virus Influenza A in vitro. Nos découvertes démontrent le potentiel de BiMuC pour recenser les petites molécules qui modulent le cycle de vie des virus enveloppés, y compris SARS-CoV-2.

Le nouveau coronavirus-2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) [1, 2] a provoqué la maladie pandémique connue sous le nom de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19). Cette maladie a eu et continue d'avoir un impact considérable sur nos systèmes de santé et l'économie mondiale. En conséquence, des efforts extraordinaires ont été déployés pour développer des mesures prophylactiques et thérapeutiques afin de réduire la morbidité et la mortalité associées à la maladie COVID-19.

La membrane cellulaire est la première barrière que le virus rencontre lorsqu'il infecte une nouvelle cellule. À un moment donné lors de l'entrée, les virus enveloppés doivent fusionner les membranes cellulaires et virales. Dans le cas du SRAS-CoV-2, la protéine de pointe (S) hautement glycosylée est responsable de l'entrée dans les cellules hôtes [3]. La protéine S, une protéine de fusion trimérique de classe I [4], est traduite sous une forme non active (S0). L'activation protéolytique de S0 par les protéases de l'hôte (c'est-à-dire TMPRSS2) produit la protéine S pré-fusion mature incorporée dans les virions [5]. Le processus infectieux commence par la liaison de la protéine S à l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2) à la surface cellulaire [2, 6]. La liaison à ACE2 déclenche un changement conformationnel, entraînant l'exposition du peptide de fusion de la protéine S, qui interagira avec la membrane hôte et initiera la fusion des membranes virale et cellulaire. Faciliter l'une des multiples étapes de ce processus complexe accélérerait et augmenterait la production virale, accélérant le développement de vaccins traditionnels, réduisant les coûts de production et augmentant le rendement de fabrication [7].

De multiples approches ont été développées pour analyser en toute sécurité l'entrée virale, y compris des tests basés sur des virus pseudo-typés, des tests basés sur des particules de type viral, des tests biochimiques ou des tests de fusion cellule-cellule. L'identification du syncytium, en raison de l'expression de la machinerie de fusion virale et du récepteur hôte correspondant à la surface cellulaire, a traditionnellement été réalisée par microscopie. Cependant, les méthodologies basées sur le microscope entravent la quantification du processus de fusion et la mise en œuvre de méthodes à haut débit pour l'identification de petites molécules.

Pour étudier le processus de fusion membranaire médiée par le SARS-CoV-2, nous avons décidé d'adapter le test de complémentation bimoléculaire multicellulaire (BiMuC) récemment développé [8]. Basé sur les propriétés de complémentation bimoléculaire d'une protéine rapporteur fluorescente, ce test facilite l'identification et la quantification des événements de fusion cellule-cellule induits par le virus sans l'aide d'un équipement basé sur un microscope. Après avoir accueilli BiMuC pour l'étude du SRAS-CoV-2, nous avons mis en place un crible de petites molécules capables de moduler le processus de fusion membranaire médiée par la protéine S. Nous avons criblé 1280 petites molécules à l'aide de ce test et identifié que l'éthynylestradiol améliore la fusion de la membrane cellulaire médiée par la protéine S. En conséquence, l'éthynylestradiol augmente la croissance du SARS-CoV-2 in vitro. De plus, l'effet sur la fusion membranaire à médiation virale ne se limite pas au SRAS-CoV-2. Nous avons démontré que l'éthynylestradiol pouvait augmenter la croissance du virus Influenza A et la fusion membranaire du virus Nipah. Nos résultats montrent que BiMuC pourrait être mis en œuvre pour surveiller le processus de fusion membranaire du SARS-CoV-2 et identifier les petites molécules qui perturbent ce processus.

Des cellules de rein canin Hek 293T, Vero E6 et Madin-Darby (MDCK) ont été obtenues auprès de l'ATCC (http://www.atcc.org) et ont été maintenues dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) (Gibco, http://www.lifetechnologies.com) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS, Gibco). Le plasmide SARS-CoV-2 S était un cadeau du Dr F. Krammer (Ichan School of Medicine at Mount Sinai). Les plasmides Jun-Nt VFP (Jun) et Fos-Ct VFP (Fos) et les plasmides humains exprimant ACE2 et TMPRSS2 ont été obtenus auprès d'Addgene (#22 012, #22 013, #1786 et #53 887, respectivement).

Pour étudier les propriétés de fusion membranaire du SARS-CoV-2, des cellules Hek 293T (DMEM additionnées de 10 % de FBS) ont été transfectées à l'aide de polyéthylèneimine (PEI) [9], soit avec SARS-CoV-2 S et Jun, soit avec ACE2 et Fos plus la pRL Renilla Luciferase (Promega) pour normaliser le signal. De plus, nous avons testé les combinaisons SARS-CoV-2 S-Fos et ACE2-Jun, une fois de plus, avec la pRL Renilla Luciferase. Le lendemain, les cellules ont été comptées, mélangées et ensemencées dans des plaques à 96 puits (1 × 105 cellules/puits dans 100 µL de milieu). Après 48 h, la fluorescence a été mesurée (λexc = 485 nm, λem = 535 nm) sur des plaques 96 puits comme décrit précédemment [10].

Pour l'identification de petites molécules ayant la capacité de moduler la fusion membranaire, le protocole a été ajusté pour répondre aux normes d'écran nécessaires. Pour évaluer la robustesse de notre test, nous avons calculé le facteur Z' et le rapport signal sur bruit (S/N). Facteur Z′ = 1 − ((3δpos + 3δneg)/(µpos − µneg)), où µpos est le signal moyen du contrôle positif, µneg est le signal moyen du contrôle négatif, δpos est l'écart type du contrôle positif et δneg est l'écart type du contrôle négatif. En bref, des cellules Hek 293T ont été ensemencées dans des boîtes de 15 cm (5 × 106 cellules/boîte) en utilisant du DMEM additionné de 10 % de FBS. Après 24 h d'incubation (37 ° C, 5% de CO2), les cellules ont été transfectées à l'aide de PEI avec le plasmide comme mentionné ci-dessus ou ont été transfectées. Le lendemain, les cellules ont été comptées, mélangées et ensemencées manuellement dans des plaques noires solides à 96 puits (1 × 105 cellules/puits dans 100 µL de milieu). Les cellules ont été mélangées en 2 pools, le pool A contenant des cellules exprimant Jun et SARS-CoV-2 S ou Fos et ACE2 et le pool B avec des cellules exprimant Jun ou Fos. Les puits des colonnes 1 à 11 ont été ensemencés avec 50 µL de cellules du pool A, tandis que la colonne 12 a reçu 50 µL de cellules du pool B. Ensuite, 50 µL des petits composés à 50 µM ont été ajoutés manuellement aux cellules (concentration finale 25 µM, 0,25 % DMSO). Nous avons utilisé une bibliothèque Prestwick Chemical (Sigma, St. Louis, MO, USA) contenant 1280 composés dans des plaques à 96 puits. Les colonnes 1 et 12 (contrôles positifs et négatifs, respectivement) ont été traitées avec du DMSO dans chaque plaque. Après 48 h d'incubation, le milieu a été remplacé par 100 µL de PBS et la fluorescence a été mesurée dans un lecteur multiplaque VictorX (Perking Elmer, Waltham, MA, USA). Les résultats obtenus à partir de l'écran ont été standardisés à l'aide du Z-Score, calculé comme suit : Z-Score = (x − µ)/δ, où x est le signal brut, µ est le signal moyen et δ est l'écart type de tous les puits contenant le composé d'une plaque. Le Z-Score indique combien d'écarts types un composé particulier est supérieur ou inférieur à la moyenne de la plaque. Les résultats primaires ont été identifiés en calculant un score Z pour chaque composé et en appliquant des critères de sélection des résultats ; Score Z > 1,5. Les succès ont été confirmés lors du dépistage secondaire. Cette fois, les cellules comprenaient la pRL-Renilla. La luminescence a été mesurée à l'aide du kit Renilla Luciferase Assay de Sigma en suivant le protocole du fabricant sur des plaques de culture de cellules blanches à 96 puits. Cette mesure facilite l'élimination des composés favorisant la division cellulaire ou la survie, augmentant ainsi le signal de fluorescence sans augmenter efficacement la fusion cellule-cellule. Pour éliminer les hits qui avaient des propriétés fluorescentes similaires à VFP, les cellules ont été ensemencées dans des plaques noires à 96 puits et traitées avec les composés dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus. Dans ce cas, la fluorescence a été mesurée comme précédemment (λexc = 485 nm, λem = 535 nm). Dans tous les dosages, [DMSO] a été maintenu à ≤ 1 %. L'analyse statistique a été faite avec Libre Office Calc.

Pour étudier l'effet sur la fusion membranaire induite par le virus Nipah, nous avons réalisé le test BiMuC original décrit dans [8]. Dans ce cas, les cellules Hek 293T ont été transfectées avec Jun-Nt, NiV F et G ou avec Fos-Ct et un plasmide codant pour la luciférase de Renilla (pRL, Promega). Ensuite, les pools de cellules ont été mélangés et traités avec le composé indiqué (la concentration de DMSO a été maintenue à 1%). Après 48 h, la fluorescence a été mesurée. Au moins trois expériences indépendantes ont été réalisées.

La toxicité des composés a été évaluée avec Cell-Titer Glo (Promega) en suivant les indications du fabricant. En bref, les cellules ont été ensemencées (~ 1 × 104 cellules/plaque) dans une plaque à 96 puits blanche opaque et traitées avec le composé approprié à la concentration indiquée pendant 48 h. Ensuite, 100 µl de réactif CellTiter-Glo® ont été ajoutés et on a laissé le signal de luminescence se stabiliser pendant 10 min. La luminescence a été enregistrée sur un lecteur multi-plaques VictorX (Perking Elmer, Waltham, MA, USA).

Les cellules Vero E6 ont été infectées à une multiplicité d'infection (MOI) de 0,01 avec le SRAS-CoV-2. Ensuite, de l'éthavérine, du rabéprazole ou de l'éthynylestradiol ont été ajoutés à la concentration appropriée. De plus, les cellules ont été traitées avec du DMSO. Après 48 h, les surnageants ont été collectés et titrés par un test de plaque standard dans des cellules VeroE6. Alternativement, les cellules MDCK ont été infectées avec IAV/WSN/33 à un MOI de 0,001. Les échantillons ont été incubés en l'absence ou en présence d'éthavérine, de rabéprazole ou d'éthynylestradiol aux concentrations indiquées pendant 48 h. Ensuite, les surnageants ont été collectés et titrés par la méthode 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) dans des cellules MDCK. Dans tous les dosages, [DMSO] a été maintenu à ≤ 1 %.

Analyse de la fusion membranaire du SARS-CoV-2 par BiMuC. Une représentation schématique du test BiMuC. Les protéines Jun et Fos ont été respectivement fusionnées aux extrémités Nt et Ct de la VFP pour créer les chimères VN-Jun et VC-Fos, désormais présentées simplement comme Jun et Fos. La reconstitution de la structure de la VFP (représentée en vert), et donc ses propriétés de fluorescence, se produit exclusivement après interaction Jun et Fos. Lorsque les chimères VN-Jun et VC-Fos sont exprimées dans des pools cellulaires séparés, aucune reconstitution n'est possible (à gauche). La fusion membranaire du SARS-CoV-2 repose sur l'interaction réussie entre le SARS-CoV-2 S et l'ACE2 humain. L'expression de ces deux protéines à la surface de deux cellules adjacentes conduit à la fusion des membranes cellulaires et à la création d'un syncytium (milieu). Lorsque les cellules fusionnées portent les chimères VN-Jun et VC-Fos, elles peuvent reconstituer la structure native VFP (représentée en vert, à gauche). Au contraire, l'inhibition de l'un des processus cellulaires ou viraux qui conduisent à la fusion membranaire, de la synthèse et de la maturation de la protéine S à son interaction avec ACE2, se traduira par l'absence de signal fluorescent. B Pour le test de fusion cellule-cellule, des cellules Hek 293T ont été transfectées avec les combinaisons de plasmides indiquées. C'est-à-dire : Jun + SARS-CoV-2 S, Fos + hACE2, Jun + hACE2, Fos + SARS-CoV-2 S, Jun + Fos, Jun, Fos, SARS-CoV-2 S, hACE2, Fos + hACE2 + TMPRSS2. Le jour suivant, les cellules de chaque groupe de cellules ont été comptées et mélangées comme indiqué. Après 48 h, la fluorescence a été mesurée. La moyenne et l'écart type d'au moins trois expériences indépendantes sont représentés (n valeurs 7, 6, 6, 6, 3, 3, respectivement). Un point plein représente la valeur individuelle de chaque expérience. Les barres vertes indiquent les échantillons avec des niveaux de fluorescence comparables au contrôle positif (Jun-Fos). Les différences statistiques sont basées sur un test t homoscédastique bilatéral (les valeurs de p sont indiquées au-dessus de la barre correspondante, ns non significatif)

Le nouveau SARS-CoV-2 est un agent hautement contagieux. De ce fait, sa manipulation nécessite des mesures de sécurité importantes, ce qui peut compliquer les protocoles de recherche. Pour faciliter l'étude du processus de fusion membranaire médiée par le SRAS-CoV-2, nous avons décidé de mettre en œuvre un test de complémentation basé sur la fluorescence [8]. L'approche BiMuC est une approche sûre et sans virus basée sur les propriétés structurelles de certaines protéines fluorescentes, telles que la protéine fluorescente Venus (VFP) [10, 11, 12, 13]. En bref, le VFP peut être divisé en deux fragments (VN et VC, respectivement), dont aucun n'est fluorescent par lui-même. Cependant, si ces deux fragments sont fusionnés à une paire de protéines en interaction qui les rapprochent, la structure native de la VFP est reconstituée et ses propriétés de fluorescence sont récupérées. Les chimères sont exprimées dans des pools cellulaires séparés avec la machinerie virale nécessaire à la fusion membranaire. Si la fusion membranaire rapproche les chimères fluorescentes, la fluorescence serait reconstituée. Au contraire, aucun signal ne serait récupéré si les conditions de formation d'un syncytium n'étaient pas remplies (Fig. 1A).

Identification de petites molécules. Une représentation schématique du test BiMuC utilisé pour l'identification de petites molécules avec des propriétés d'amélioration de la fusion membranaire. B Représentation du flux de travail de l'écran des petites molécules et validation des résultats obtenus

Pour tester si nous pouvions appliquer cette méthodologie à l'étude de la fusion membranaire induite par le SRAS-CoV-2, les partenaires d'interaction c-Jun et c-Fos [14] ont été liés aux fragments VN et VC de la VFP, générant les chimères c-Jun/VN et c-Fos/VC, désormais présentées simplement comme Jun et Fos. Ces chimères ont été exprimées dans deux pools de cellules indépendants avec SARS-CoV-2 S (Jun-S) et ACE2 (Fos-ACE2), respectivement. De plus, nous avons inclus des cellules transfectées avec Jun et Fos ensemble (Jun-Fos), Jun, Fos, S, ACE2 ou un plasmide vide (Empty) dans le test. Après la transfection, les pools de cellules ont été combinés comme indiqué et incubés pendant 48 h supplémentaires (Fig. 1B). Les échantillons contenant des cellules transfectées avec Jun-S et Fos-ACE2 ont montré un signal de fluorescence significativement plus fort que ceux qui combinaient des pools de cellules exprimant Jun et Fos ou S et ACE2 (témoins négatifs) suggérant qu'une fusion réussie des membranes cellulaires déclenchée par la machinerie virale a réuni les deux chimères et a facilité la reconstitution du signal fluorescent (Fig. 1B). Notez que nous avons également testé les combinaisons Jun-ACE2 et Fos-S. Nos données suggèrent que la méthodologie BiMuC pourrait être mise en œuvre pour étudier en toute sécurité la fusion membranaire médiée par le SRAS-CoV-2. Des images de syncytia induites par SARS-CoV-2 S peuvent être trouvées dans la Fig. 1 supplémentaire.

L'identification de petites molécules qui influencent le cycle de vie viral nécessite souvent des protocoles de criblage à haut débit (HTS) évolutifs et robustes. Ces procédures doivent également être sûres dans le cas de virus hautement pathogènes, tels que le SRAS-CoV-2. Pour démontrer que le test SARS-CoV-2 BiMuC pourrait être utilisé dans des conditions à haut débit, nous avons mis en place un test pour identifier les petites molécules qui influencent le processus de fusion membranaire médié par SARS-CoV-2. Nous nous sommes particulièrement intéressés aux petites molécules qui pourraient favoriser l'entrée virale. Malgré l'introduction de nouvelles plateformes de vaccins, la production de vaccins repose souvent sur la production de grandes quantités de virus. En conséquence, diverses stratégies ont été mises en œuvre pour augmenter la production virale, de la sélection cellulaire à l'optimisation des procédures de réplication [15,16,17]. Une molécule capable de faciliter la fusion virale-membrane améliorerait théoriquement la croissance virale et pourrait être utilisée pour faciliter la production de vaccins traditionnels [7].

Notre test est basé sur des cellules Hek 293T, qui expriment de faibles niveaux d'ACE2 et de TMPRSS2 [18, 19]. Bien que l'ACE2 ait été complété en trans, nous n'avons intentionnellement pas inclus TMPRSS2 dans notre test pour mettre en place un état de fusion sous-optimal qui facilite l'identification de petites molécules qui améliorent la formation de syncytia. Accélérer ou augmenter la production de virus accélérerait le développement de vaccins, réduirait les coûts de production et augmenterait le rendement de fabrication [20]. Pour confirmer que notre test peut identifier une augmentation de la fusion virale, nous avons inclus TMPRSS2 dans le mélange de transfection avec ACE2 (Fos-ACE2-TMPRSS2). Comme prévu, l'ajout de cette sérine protéase a augmenté le signal fluorescent observé (Fig. 1B). Ces résultats confirment que notre configuration pourrait identifier des composés qui améliorent la fusion membranaire virale-cellulaire.

Ensuite, nous avons adapté notre méthodologie pour le HTS de petites molécules et vérifié sa pertinence par le facteur Z′ (0,63 ou 0,62 pour les combinaisons Jun-S + Fos-ACE2 ou Jun-ACE2 + Fos-S, respectivement) [21]. En bref, des cellules Hek 293T ont été transfectées avec Jun-S ou Fos-ACE2 plus un plasmide codant pour la luciférase de Renilla sous un promoteur constitutif. Après transfection, les pools de cellules ont été mélangés comme décrit ci-dessus, ensemencés sur des plaques à 96 puits et traités avec la petite molécule appropriée. Chaque plaque comprenait une colonne de puits traités au DMSO. De plus, les plaques comprenaient 8 puits comme contrôle négatif contenant des cellules transfectées avec Jun ou Fos (les deux pools de cellules ont été combinés comme précédemment) et traitées avec du DMSO. Une fois traitées, les cellules ont été incubées pendant 48 h, suivies d'une mesure de fluorescence et d'une sélection de coups (Fig. 2A).

Analyse des composés touchés. A–F Des composés sélectionnés ont été rachetés et leur capacité à augmenter la formation de syncytia a été testée avec le test BiMuC. En bref, les cellules Hek293T ont été transfectées avec les protéines Jun plus SARS-CoV 2 S et indépendamment avec Fos et ACE2 humain. Après 24 h, les échantillons ont été combinés et traités avec le composé approprié à la concentration indiquée ou un traitement fictif pendant 48 h. Ensuite, la fluorescence, indicative du pourcentage de fusion a été calculée. Les pourcentages de fluorescence sur les échantillons traités par simulation (DMSO) sont représentés. La moyenne et l'écart type d'au moins trois expériences indépendantes sont indiqués. Les points représentent des expériences individuelles. Sur la base d'un test t homoscédastique unilatéral, les différences statistiques entre les échantillons composés et simulés ont été calculées. La valeur p est affichée lorsque des différences significatives sont trouvées

Une bibliothèque composée de 1280 petites molécules chimiquement diverses (Prestwick Chemical, GreenPharma) a été criblée et les résultats ont été standardisés par le Z-Score ; 76 résultats primaires ont été sélectionnés sur la base d'un score Z> 1,5 (tableau S1). Les résultats ont été retestés en utilisant les mêmes conditions expérimentales et critères de sélection. Seuls les composés capables d'améliorer la fusion virale dans les deux cycles ont été pris en compte (Fig. 2B). De plus, nous avons mesuré la luminescence de la luciférase de Renilla et éliminé les composés favorisant la division cellulaire ou la survie, augmentant ainsi le signal de fluorescence sans augmenter efficacement la fusion cellule-cellule. Nous avons également testé les propriétés de fluorescence des touches restantes et rejeté les composés émettant près de 530 nm (Fig. 2B).

Au total, 6 composés ont été sélectionnés ; ceux-ci ont été rachetés auprès d'un fournisseur différent et re-testés à plusieurs concentrations pour confirmer leur capacité à améliorer la fusion de la membrane virale dans Hek 293T. Les composés ont été incubés pendant 48 ou 72 h (Figs. 3 et 4). Nous avons observé une augmentation modeste de la fusion membranaire induite par le virus lorsque les composés ont été incubés pendant 48 h ; le latanoprost, la simvastatine et l'éthynylestradiol étaient les inducteurs les plus puissants. Cependant, après 72 h d'incubation, la plupart des composés (sauf diperodon) améliorent le signal de fluorescence. Une dose-réponse limitée a été observée lorsque les composés ont été incubés pendant 48 h. Cependant, une plus forte dépendance à la dose a été observée 72 h après le traitement.

Analyse des composés touchés après 72 h d'incubation. A – F La capacité des composés sélectionnés à augmenter la formation de syncytia a été testée avec le test BiMuC dans des cellules Hek293T. En bref, les cellules Hek293T ont été transfectées avec les protéines Jun plus SARS-CoV 2 S et indépendamment avec Fos et ACE2 humain. Après 24 h, les échantillons ont été combinés et traités avec le composé approprié à la concentration indiquée ou simulés pendant 72 h. Les pourcentages de fluorescence sur les échantillons traités par simulation (DMSO) sont représentés. La moyenne et l'écart type d'au moins trois expériences indépendantes sont indiqués. Les points représentent des expériences individuelles. Sur la base d'un test t homoscédastique unilatéral, les différences statistiques entre les échantillons composés et simulés ont été calculées. Lorsque les différences sont significatives, la valeur de p est indiquée

Analyse des composés touchés en présence de TMPRSS2. A – F La capacité des composés sélectionnés à augmenter la formation de syncytia en présence de TMPRSS2 a été testée avec le test BiMuC. Les cellules Hek293T ont été transfectées avec TMPRSS2 aux côtés de la machinerie virale et cellulaire nécessaire à la formation de syncytia. Ensuite, les cellules ont été mélangées et traitées avec le composé approprié pendant 48 h. Les pourcentages de fluorescence sur les échantillons traités par simulation (DMSO) sont représentés. La moyenne et l'écart type d'au moins trois expériences indépendantes sont indiqués. Les points représentent des expériences individuelles. Sur la base d'un test t homoscédastique unilatéral, les différences statistiques entre les échantillons composés et simulés ont été calculées. Lorsque les différences sont significatives, la valeur de p est indiquée

Ensuite, pour identifier si les composés sélectionnés pouvaient induire une augmentation de la fusion virale dans des conditions de croissance optimales, nous les avons testés en présence de TMPRSS2 après 48h d'incubation. Dans ce cas, l'effet stimulant des composés était sensiblement plus fort que sans la protéase (Fig. 5). Il convient de noter qu'une fois la protéase ajoutée, une réponse dépendante de la concentration a été observée.

Nous avons également dosé la toxicité de ces 6 composés en mesurant la teneur en ATP dans les cellules (Fig. 6). Dans les cellules Hek 293T, les six composés ont démontré une certaine toxicité à des concentrations élevées. Fait intéressant, malgré la toxicité à ces concentrations, nous avons observé une augmentation de la fusion cellule-cellule. La CC50 et l'activité de fusion cellule-cellule à cette concentration sont présentées dans le tableau 1 ; la colonne de gauche met en évidence un indice d'activité (le pourcentage de fusion cellule-cellule divisé par le CC50). De plus, la toxicité de l'éthynylestradiol a été testée en présence de TMPRSS2 (Fig. S2). Les résultats indiquent que la toxicité du composé n'a pas été affectée par la présence de la protéase cellulaire. Nous avons également analysé la toxicité de ces composés dans les cellules Vero, une lignée cellulaire largement utilisée pour cultiver des virus in vitro à des fins vaccinales [15] (Fig. 6). Dans cette lignée cellulaire, la simvastatine (CC50 ~ 6 µM) a clairement montré une toxicité supérieure au reste des composés. Sur la base de ces résultats (efficacité et toxicité), nous avons décidé de nous concentrer désormais sur l'éthavérine, le rabéprazole et l'éthynylestradiol.

Toxicité des composés touchés. A, B La toxicité dans les cellules Hek 293T et Vero E6 (A et B, respectivement) a été analysée après incubation des composés à la concentration indiquée pendant 48 h. La toxicité a été analysée en mesurant les niveaux d'ATP à l'aide du test Cell-Titer Glo (Promega) en suivant les indications du fabricant. Les points représentent la moyenne d'au moins trois expériences indépendantes. C Les valeurs CC10, CC50 et CC90 ont été calculées avec les données présentées dans les panneaux A et B

Pour analyser plus en détail le rôle des composés sélectionnés (éthynylestradiol, éthavérine et rabéprazole) sur l'entrée des virus enveloppés, nous avons porté notre attention sur le virus Nipah (NiV). Le NiV, membre de la famille des Paramyxoviridae, a besoin de deux protéines pour réaliser la fusion des membranes virale et cellulaire, la glycoprotéine (G) qui se fixe à une protéine réceptrice à la surface de la cellule réceptrice et la protéine de fusion (F) qui à son tour va forcer la fusion des membranes cellulaire et virale. NiV est un agent restreint BSL4. Par conséquent, pour tester l'effet de l'éthynylestradiol, de l'éthavérine et du rabéprazole, nous avons utilisé le test BiMuC adapté à l'étude de l'entrée du NiV [8]. Nos résultats indiquent, une fois de plus, que ces trois composés peuvent améliorer la fusion membranaire à médiation virale de manière légèrement dépendante de la dose (Fig. 7).

Effet de l'éthynylestradiol, de l'éthavérine et du rabéprazole sur la fusion membranaire du virus Nipah. Pour tester l'effet de l'éthynylestradiol, de l'éthavérine et du rabéprazole sur la fusion membranaire NiV, des cellules Hek 293T ont été transfectées avec des plasmides codant NiV F, G et Jun ou avec Fos. Environ 24 h plus tard, les pools de cellules ont été mélangés et le composé approprié a été ajouté aux concentrations indiquées. Après 48 h, la fluorescence a été mesurée. Les barres montrent la moyenne et l'écart type d'au moins trois expériences indépendantes. Les données sont présentées sous la forme d'un pli sur les échantillons fictifs. Fos). Sur la base d'un test t homoscédastique unilatéral (les valeurs de p sont indiquées au-dessus de la barre correspondante, ns non significatif), les différences statistiques entre les échantillons composés et les échantillons traités par simulation ont été calculées. Lorsque les différences étaient significatives, la valeur de p était indiquée

Notre test est basé sur la formation de syncytia, qui pourrait ne pas récapituler avec précision la fusion des membranes virales et cellulaires lors d'une infection. Par conséquent, à ce stade, nous décidons d'analyser l'effet des composés touchés sur la croissance virale du SRAS-CoV-2 [18, 22, 23]. Nos résultats ont indiqué que le rabéprazole et l'éthynylestradiol augmentaient les titres viraux 48 h après l'infection à des concentrations inférieures au CC50 (Fig. 8A), bien qu'aucune différence significative n'ait été trouvée entre les échantillons traités et non traités. En revanche, l'éthavérine n'a pas augmenté ni accéléré la croissance du SARS-CoV-2 (Fig. 8A).

Effet de composés sélectionnés sur le SRAS-CoV-2 et l'IAV. Un SARS-CoV-2 a été cultivé à une multiplicité d'infection (MOI) de 0,01 dans des cellules Vero E6 pendant 48 h en l'absence ou en présence d'éthavérine, de rabéprazole ou d'éthynylestradiol aux concentrations indiquées. Ensuite, les surnageants ont été collectés et titrés par un test de plaque standard dans des cellules Vero E6. Les barres montrent la moyenne des unités formant plaque (pfu) et l'écart type d'au moins trois expériences indépendantes. Les points représentent des expériences individuelles. Aucune différence statistique, basée sur un test t homoscédastique bilatéral, n'a été trouvée entre les échantillons traités et simulés. B IAV/WSN/33, à un MOI de 0,001, a été utilisé pour infecter des cellules rénales canines Madin-Darby (MDCK). L'IAV a été incubé en l'absence ou en présence d'éthavérine, de rabéprazole ou d'éthynylestradiol aux concentrations indiquées pendant 48 h. Ensuite, les surnageants ont été collectés et titrés par la méthode 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) dans des cellules MDCK. Les barres montrent la moyenne des unités formant plaque (pfu) et l'écart type d'au moins trois expériences indépendantes. Les points représentent des expériences individuelles. Sur la base d'un test t homoscédastique bilatéral, aucune différence statistique n'a été trouvée entre les échantillons traités et simulés

Ensuite, nous avons analysé si la capacité de ces composés à améliorer la croissance virale était limitée au SRAS-CoV-2. Pour ce faire, nous avons testé l'effet de l'éthavérine, du rabéprazole et de l'éthynylestradiol sur la croissance du virus Influenza A (IAV). L'IAV provoque une morbidité et une mortalité annuelles importantes avec des flambées épidémiques saisonnières. Les épidémies de grippe saisonnière peuvent être gérées par la vaccination, et des vaccins multivalents contenant des composants du virus de l'IAV et de la grippe B sont largement distribués chaque année. Comme le SRAS-CoV-2, l'IAV est un virus enveloppé qui repose sur une protéine de fusion de classe I, la protéine hémagglutinine (HA), pour la fusion des membranes virale et cellulaire.

Nous avons effectué des infections à IAV dans des cellules de rein canin de Madin-Darby (MDCK) en présence et en l'absence des composés sélectionnés [24]. Nos résultats indiquent que l'éthynylestradiol augmente les titres IAV d'environ un log (Fig. 8B), bien qu'aucune différence significative n'ait été trouvée. En revanche, l'éthavérine et le rabéprazole n'ont pas augmenté les titres viraux (Fig. 8B).

La plupart des composés inclus dans la chimiothèque utilisée dans notre sélection sont des médicaments approuvés et sont actuellement utilisés dans plusieurs traitements. Cependant, il est important de noter que nos expériences sont insuffisantes pour affirmer que les composés touchés, y compris l'éthynylestradiol, pourraient aggraver l'issue d'un patient lors d'une infection par un virus enveloppé.

En résumé, nos résultats suggèrent que l'éthynylestradiol pourrait être utilisé in vitro pour améliorer la croissance des virus enveloppés. D'après des travaux antérieurs [25,26,27,28,29], l'éthynylestradiol pourrait altérer les propriétés des membranes virales et cellulaires pour faciliter la fusion membranaire et/ou l'endocytose virale. Des composés tels que le polybrène sont utilisés pour améliorer les infections à rétrovirus en facilitant l'adhésion des virions à la surface cellulaire puisque l'ajout de polycations chargés positivement réduit les forces répulsives entre la cellule et le virus, améliorant ainsi l'efficacité de la transduction [30]. Cependant, à notre connaissance, aucun composé qui améliore la fusion membranaire et par la suite augmente et accélère la croissance virale n'a été identifié auparavant.

Nos résultats démontrent que BiMuC peut être mis en œuvre pour surveiller le processus de fusion membranaire du SARS-CoV-2. De plus, nous montrons que cette méthodologie convient à l'identification à haut débit de petites molécules qui influencent l'entrée virale de certains virus enveloppés et, par conséquent, la croissance virale.

Toutes les données de l'étude sont incluses dans l'article et/ou les informations supplémentaires.

Wu F, Zhao S, Yu B, Chen YM, Wang W, Song ZG, et al. Un nouveau coronavirus associé à une maladie respiratoire humaine en Chine. Nature. 2020;579:265–9.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou P, Yang XL, Wang XG, Hu B, Zhang L, Zhang W, et al. Une épidémie de pneumonie associée à un nouveau coronavirus d'origine probable de chauve-souris. Nature. 2020;579:270–3.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim D, Lee JY, Yang JS, Kim JW, Kim VN, Chang H. L'architecture du transcriptome du SRAS-CoV-2. Cellule. 2020;181:914–921e10.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wrapp D, Wang N, Corbett KS, Goldsmith JA, Hsieh CL, Abiona O, et al. Structure Cryo-EM du pic 2019-nCoV dans la conformation de préfusion. Science. 2020;367:1260–3.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang H, Rao Z. Biologie structurale du SRAS-CoV-2 et implications pour le développement thérapeutique. Nat Rev Microbiol. 2021;19:685–700.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang Q, Zhang Y, Wu L, Niu S, Song C, Zhang Z, et al. Base structurelle et fonctionnelle de l'entrée du SRAS-CoV-2 en utilisant l'ACE2 humain. Cellule. 2020;181:894–904e9.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rando HM, Lordan R, Lee AJ, Naik A, Wellhausen N, Sell E, et al. Application des stratégies traditionnelles de développement de vaccins au SRAS-CoV-2. mSystèmes. Volume 0. Société américaine de microbiologie ; 2023. pp. e00927–22.

García-Murria MJ, Expósito-Domínguez N, Duart G, Mingarro I, Martinez-Gil L. Un système de complémentation multicellulaire bimoléculaire pour la détection de la formation de Syncytium : une nouvelle méthodologie pour l'identification des inhibiteurs d'entrée du virus Nipah. Virus. 2019;11.

Islam MA, Park TE, Singh B, Maharjan S, Firdous J, Cho MH, et al. Principaux polycations dégradables comme porteurs d'ADN et d'ARNsi. J Control Release Off J Control Release Soc. 2014;193:74–89.

Article CAS Google Scholar

Grau B, Javanainen M, García-Murria MJ, Kulig W, Vattulainen I, Mingarro I, et al. Le rôle de l'appariement hydrophobe sur l'emballage de l'hélice transmembranaire dans les cellules. Stress cellulaire. 2017;1:90–106.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Kerppola TK. Conception et mise en œuvre de tests de complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) pour la visualisation des interactions protéiques dans les cellules vivantes. Protocole Nat. 2006;1:1278–86.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Magliery TJ, Wilson CGM, Pan W, Mishler D, Ghosh I, Hamilton AD, et al. Détection des interactions protéine-protéine avec un piège de réassemblage de fragments de protéines fluorescentes vertes : portée et mécanisme. J Am Chem Soc. 2005;127:146–57.

Article CAS PubMed Google Scholar

García-Murria MJ, Duart G, Grau B, Diaz-Beneitez E, Rodríguez D, Mingarro I, et al. Le domaine transmembranaire de Bcl2 viral interagit avec les protéines Bcl2 de l'hôte pour contrôler l'apoptose cellulaire. Nat Commun. 2020;11:6056.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

van Dam H, Castellazzi M. Rôles distincts de Jun : Fos et Jun : dimères ATF dans l'oncogenèse. Oncogène. 2001;20:2453–64.

Article PubMed Google Scholar

Barrett PN, Terpening SJ, Snow D, Cobb RR, Kistner O. Technologie cellulaire Vero pour le développement rapide de vaccins à virus entier inactivé pour les maladies virales émergentes. Expert Rev Vaccins. 2017;16:883–94.

Article CAS PubMed Google Scholar

Kiesslich S, Kamen AA. Développement en amont de bioprocédés de cellules Vero pour la production de vecteurs viraux et de vaccins. Biotechnol Adv. 2020;44:107608.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tapia F, Vázquez-Ramírez D, Genzel Y, Reichl U. Bioréacteurs pour une densité cellulaire élevée et des cultures continues en plusieurs étapes : options d'intensification des processus dans la production de vaccins viraux basés sur la culture cellulaire. Appl Microbiol Biotechnol. 2016;100:2121–32.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Matsuyama S, Nao N, Shirato K, Kawase M, Saito S, Takayama I, et al. Isolement amélioré du SARS-CoV-2 par les cellules exprimant TMPRSS2. Proc Natl Acad Sci US A. 2020;117:7001–3.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hoffmann M, Kleine-Weber H, Schroeder S, Krüger N, Herrler T, Erichsen S, et al. L'entrée des cellules SARS-CoV-2 dépend de l'ACE2 et du TMPRSS2 et est bloquée par un inhibiteur de protéase cliniquement prouvé. Cellule. 2020;181:271–280e8.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fang Z, Lyu J, Li J, Li C, Zhang Y, Guo Y et al. Application de la technologie des bioréacteurs pour la production de vaccins viraux à base de culture cellulaire : situation actuelle et perspectives d'avenir. Avant Bioeng Biotechnol [Internet]. 2022 [cité le 20 septembre 2022] ;10. Disponible sur : https://www.frontiersin.org/articles/https://doi.org/10.3389/fbioe.2022.921755.

Zhang J, Chung T, Oldenburg K. Un paramètre statistique simple à utiliser dans l'évaluation et la validation des tests de dépistage à haut débit. Écran J Biomol. 1999;4:67–73.

Article CAS PubMed Google Scholar

Cas JB, Bailey AL, Kim AS, Chen RE, Diamond MS. Croissance, détection, quantification et inactivation du SRAS-CoV-2. Virologie. 2020;548:39–48.

Article CAS PubMed Google Scholar

Zaliani A, Vangeel L, Reinshagen J, Iaconis D, Kuzikov M, Keminer O, et al. Dépistage cytopathique du SRAS-CoV-2 sur les cellules VERO-E6 dans le cadre d'un effort de réorientation à grande échelle. Sci Data Nature Publishing Group. 2022;9:4

CAS Google Scholar

Martinez-Gil L, Alamares-Sapuay JG, Ramana Reddy MV, Goff PH, Premkumar Reddy E, Palese P. Un inhibiteur multi-kinase à petite molécule réduit la réplication du virus de la grippe en limitant la synthèse de l'ARN viral. Antiviral Res. 2013;100:29–37.

Article CAS PubMed Google Scholar

Bossard R, Stieger B, O'Neill B, Fricker G, Meier PJ. Le traitement à l'éthinylestradiol induit de multiples altérations canaliculaires du transport membranaire dans le foie du rat. J Clin Invest. 1993;91:2714–20.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cuevas MJ, Mauriz JL, Almar M, Collado PS, González-Gallego J. Effet de l'épomédiol sur les changements induits par l'éthinylestradiol dans le métabolisme des acides biliaires et du cholestérol chez le rat. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2001;28:637–42.

Article CAS PubMed Google Scholar

Elias E, Iqbal S, Knutton S, Hickey A, Coleman R. Augmentation de la perméabilité des jonctions serrées : un mécanisme possible de la cholestase des œstrogènes. Eur J Clin Invest. 1983;13:383–90.

Article CAS PubMed Google Scholar

Miccio M, Orzes N, Lunazzi GC, Gazzin B, Corsi R, Tiribelli C. Inversion de la cholestase induite par l'éthinylestradiol par l'épomédiol chez le rat. Le rôle de la fluidité de la membrane plasmique du foie. Biochem Pharmacol. 1989;38:3559–63.

Article CAS PubMed Google Scholar

Van Dyke RW, Root KV. L'éthinylestradiol diminue l'acidification des vésicules endocytaires du foie de rat. Hepatol Baltim Md. 1993;18:604–13.

Google Scholar

Cornetta K, Anderson WF. Le sulfate de protamine comme alternative efficace au polybrène dans le transfert de gènes à médiation rétrovirale : implications pour la thérapie génique humaine. Méthodes Virol J. 1989;23:187–94.

Article CAS PubMed Google Scholar

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Ce travail a été soutenu par la Generalitat Valenciana (PROMETEO/2019/065) et subvention PID2020-119111GB-I00 par MCIN/AEI/10.13039/501100011033. OZ est financé par la subvention PID2020-114546RB par MCIN/AEI/10.13039/501100011033. LG est titulaire d'un contrat prédoctoral (CIACIF/2021/119) de la Generatitat Valenciana. MR-S est titulaire d'un contrat prédoctoral du ministère espagnol des sciences et de l'innovation (PRE2021-101042 par MCIN/AEI/10.13039/501100011033). Cette publication a également été soutenue par le projet European Virus Archive GLOBAL (EVA-GLOBAL) qui a reçu un financement du programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne dans le cadre de la convention de subvention 871029.

Département de biochimie et de biologie moléculaire, Institut universitaire de biotechnologie et de biomédecine (BIOTECMED), Université de Valence, Burjassot, E-46100, Espagne

Mª Jesús García-Murria, Laura Gadea-Salom, Marina Rius-Salvador, Ismael Mingarro & Luis Martínez-Gil

Centre de recherche sur la santé animale, CISA (Institut national de recherche et de technologie agricoles et alimentaires/Consejo Superior de Investigaciones Científicas (INIA/CSIC)), Madrid, Espagne

Sandra Moreno et Alejandro Brun

Laboratoire de référence en mycologie, Centre national de microbiologie, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, Madrid, Espagne

Oscar Saragosse

Centre de recherche biomédicale en réseau sur les maladies infectieuses (CIBERINFEC, Institut de santé Carlos III, CB21/13/00105), Madrid, Espagne

Oscar Saragosse

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Recherche conçue par MJGM, OZ, AB, IM et LMG ; MJGM, LGS, SM, MRS et LMG ont effectué des recherches ; MJGM, AB, IM et LMG ont analysé les données ; LMG a écrit le papier.

Correspondance à Luis Martínez-Gil.

L'Université de Valence a déposé une demande de brevet relative à l'utilisation de l'éthynylestradiol pour augmenter la croissance virale.

N'est pas applicable.

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. Syncytia induite par la protéine SARS-CoV-2 S. Les cellules Hek 293T ont été transfectées avec la protéine S du SRAS-CoV-2 et des plasmides codant pour l'ACE2 humain (AC) ou ont été transfectées de manière factice (D). Après 24 heures, les cellules ont été visualisées à l'aide d'un microscope Motic AE200 avec un objectif 10x

Toxicité de l'éthynylestradiol en présence de TMPRRS2. A et B. Pour analyser l'effet de TMPRSS2 sur la toxicité de l'éthynylestradiol, des cellules Hek 293T ont été transfectées avec TMPRR22 ou eYFP et 48 heures plus tard, la toxicité a été dosée. La toxicité a été analysée en mesurant les niveaux d'ATP à l'aide du test Cell-Titer Glo (Promega) en suivant les indications du fabricant. Les points représentent la moyenne de deux expériences indépendantes. Les valeurs CC10, CC50 et CC90 sont indiquées

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Réimpressions et autorisations

García-Murria, MJ, Gadea-Salom, L., Moreno, S. et al. Identification de petites molécules capables d'améliorer la fusion membranaire virale. Virol J 20, 99 (2023). https://doi.org/10.1186/s12985-023-02068-1

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Reçu : 07 février 2023

Accepté : 09 mai 2023

Publié: 24 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1186/s12985-023-02068-1

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