Oxydation simultanée du sulfure et du méthane par un extrêmophile

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 2974 (2023) Citer cet article

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Le sulfure d'hydrogène (H2S) et le méthane (CH4) sont produits dans des environnements anoxiques par réduction des sulfates et décomposition de la matière organique. Les deux gaz diffusent vers le haut dans les zones oxiques où les méthanotrophes aérobies atténuent les émissions de CH4 en oxydant ce puissant gaz à effet de serre. Bien que les méthanotrophes dans une myriade d'environnements rencontrent du H2S toxique, on ne sait pratiquement pas comment ils sont affectés. Ici, grâce à une culture chimiostatique extensive, nous montrons qu'un seul micro-organisme peut oxyder simultanément le CH4 et le H2S à des taux également élevés. En oxydant le H2S en soufre élémentaire, le méthanotrophe thermoacidophile Methylacidiphilum fumariolicum SolV atténue les effets inhibiteurs du H2S sur la méthanotrophie. La souche SolV s'adapte à l'augmentation de H2S en exprimant une oxydase terminale de type ba3 insensible au sulfure et se développe en tant que chimiolithoautotrophe en utilisant H2S comme seule source d'énergie. Des études génomiques ont révélé des enzymes putatives oxydant les sulfures chez de nombreux méthanotrophes, suggérant que l'oxydation du H2S est beaucoup plus répandue chez les méthanotrophes qu'on ne le supposait auparavant, leur permettant de connecter les cycles du carbone et du soufre de nouvelles façons.

Le sulfure d'hydrogène (H2S) est la forme la plus réduite de soufre (S) et une puissante source d'énergie et de soufre, un toxique et une molécule de signalisation1,2,3. C'est un acide faible qui diffuse facilement à travers les membranes et inhibe divers processus tels que la respiration aérobie en se liant aux cytochrome c oxydases. De plus, d'autres processus métaboliques qui utilisent des enzymes contenant du cuivre et du fer sont sévèrement inhibés par H2S1,4,5,6. Par conséquent, les micro-organismes vivant dans des environnements riches en sulfure nécessitent des mécanismes adéquats pour détoxifier le H2S7,8. Dans une myriade d'environnements, tels que les zones humides, les sédiments marins, le sol, les stations d'épuration des eaux usées, les lacs, les rizières, les décharges et les environnements géothermiques acides, le H2S est produit par la réduction des sulfates (SO42−), la minéralisation de la matière organique et la thermochimie8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18.

Lors de l'épuisement du sulfate, la matière organique est finalement convertie en méthane (CH4) dans les écosystèmes appauvris en oxygène9,12,13,19,20,21. Lorsque le H2S et le CH4 diffusent dans les zones oxiques superposées, le CH4 peut être utilisé comme source d'énergie par les bactéries aérobies oxydant le méthane, qui sont censées atténuer la plupart des émissions de ce puissant gaz à effet de serre22. Malgré ce biofiltre à méthane efficace, 548 à 736 Tg de CH4 sont rejetées annuellement dans l'atmosphère à partir de diverses sources naturelles et anthropiques23,24. Les méthanotrophes aérobies font partie de diverses classes et familles bactériennes, notamment les Alpha- et Gammaproteobacteria16,25,26, les Actinobacteria27 et les extrêmophiles Methylacidiphilaceae du phylum Verrucomicrobia28,29,30,31. Ces dernières sont des bactéries acidophiles qui partagent un faible pH optimum (2,0 − 3,5) et vivent entre 35 et 60 °C26,31,32. Tous les méthanotrophes verrucomicrobiens connus ont été isolés d'habitats géothermiques tels que les fumerolles et les mudpots, à partir desquels de grandes quantités de CH4 et de H2S, principalement thermogéniques, sont émises16,28,33,34,35. Les environnements géothermiques sont généralement caractérisés par des émissions élevées de H2S et, par conséquent, les méthanotrophes verrucomicrobiens isolés de ces écosystèmes sont des exemples prééminents pour étudier comment les méthanotrophes sont affectés par le H2S.

Il devient de plus en plus clair que les méthanotrophes sont métaboliquement polyvalents et capables d'utiliser des sources d'énergie pertinentes pour l'environnement telles que le H2, le propane, l'éthane, l'acétate, l'acétone, le 2-propanol et l'acétol16,36,37,38. La possibilité d'utiliser diverses sources d'énergie est très bénéfique dans les environnements où les émissions de gaz fluctuent fortement. Récemment, il a été démontré que des cultures pures du méthanotrophe verrucomicrobien Methylacidiphilum fumariolicum SolV peuvent consommer du méthanethiol (CH3SH), avec la formation sous-stoechiométrique concomitante de H2S, indiquant que la souche SolV a partiellement métabolisé le H2S39 toxique. Par la suite, une étude élégante a démontré que les méthanotrophes protéobactériennes peuvent également oxyder le H2S40. Les auteurs ont isolé la souche polyvalente HY1 de l'alphaprotéobactérie 'Methylovirgula thiovorans' d'une tourbière sud-coréenne qui pouvait se développer sur du thiosulfate (S2O32−), du tétrathionate (S4O62−), du soufre élémentaire (S0) et une gamme de composés carbonés. Cependant, les cellules de la souche HY1 cultivées sur CH4 comme seule source d'énergie n'étaient pas capables d'oxyder le H2S, et l'oxydation du H2S n'a été initiée et observée que dans les cellules cultivées en présence de thiosulfate. De plus, la croissance sur H2S n'a pas été étudiée. Compte tenu des observations récentes, il est primordial de déterminer s'il existe des microbes capables d'oxyder simultanément les gaz CH4 et H2S pertinents pour l'environnement, comment les méthanotrophes font face au H2S et si ces méthanotrophes peuvent conserver l'énergie et produire de la biomasse en utilisant le H2S comme source d'énergie.

Ici, grâce à une culture extensive de chemostat, nous montrons pour la première fois qu'un micro-organisme peut oxyder simultanément le CH4 et le H2S. M. fumariolicum SolV est inhibé par la présence de concentrations élevées de H2S, mais le H2S est rapidement oxydé en soufre élémentaire (S0) en tant que mécanisme de détoxification pour atténuer l'effet inhibiteur du H2S sur l'oxydation du CH4. La souche SolV s'adapte au H2S avec la régulation à la hausse d'une sulfure de type III:quinone oxydoréductase (SQR) et d'une cytochrome c oxydase de type ba3 insensible au H2S, créant une voie de transfert d'électrons du H2S vers l'O2. De plus, la souche SolV incorpore du 13CO2 en utilisant H2S comme seule source d'énergie. Nous proposons que la capacité d'oxydation du H2S des méthanotrophes verrucomicrobiens est essentielle pour prospérer dans les écosystèmes géothermiques acides riches en soufre. De plus, nous avons trouvé SQR dans une pléthore de méthanotrophes protéobactériennes de divers environnements. Considérant que le CH4 et le H2S coexistent dans une myriade d'écosystèmes limités en oxygène, l'oxydation du H2S pourrait être un trait présent chez de nombreux méthanotrophes aérobies.

La détection de gènes codant putatifs sulfure:quinone oxydoréductases (SQR) dans les génomes de méthanotrophes verrucomicrobiens nous a incités à rechercher si les méthanotrophes peuvent s'oxyder et s'adapter à H2S16. En conséquence, une culture continue du méthanotrophe aérobie thermoacidophile Methylacidiphilum fumariolicum SolV (fonctionnant comme chimiostat à un taux de dilution (D) de 0,016 h-1) a été maintenue avec du CH4 comme source d'énergie et du CO2 comme source de carbone (cellules non adaptées ; Fig. 1a), jusqu'à une charge de 39 μmol CH4 min-1 · g DW-1 (tableau 1). À titre de comparaison, un système de culture continue distinct a été conçu (avec une charge de CH4 identique) pour adapter les cellules à des charges croissantes de H2S (Fig. 1 supplémentaire). Les cellules qui poussent dans ce chémostat oxydent simultanément le H2S et le CH4 (cellules adaptées au sulfure ; Fig. 1b), jusqu'à des charges concurrentes de 42 μmol H2S · min−1 · g DW−1 et de 38 μmol CH4 · min−1 · g DW−1 (Tableau 1), tandis que la concentration en H2S dans la sortie de gaz reste inférieure à 2 nmol · L−1. Des cultures continues à l'état d'équilibre de cellules non adaptées et adaptées au sulfure pourraient être maintenues pendant de nombreuses générations (Fig. 1a, b). L'accumulation de soufre élémentaire (S0) au cours des semaines de croissance était évidente, car des quantités croissantes d'un précipité jaune (particules microscopiques irrégulières) se développaient et se fixaient aux parties métalliques et aux parois du chémostat (Fig. 2 supplémentaire). Après quelques semaines de fonctionnement avec du H2S, il a été identifié comme contenant plus de 99 % de soufre pur et la quantité pouvait représenter au moins 80 % du sulfure converti au cours de cette période. Grâce à la microscopie, seules des quantités infimes de particules de soufre dans le liquide ont pu être observées, contrairement aux cellules bactériennes. Les cultures non adaptées et adaptées au sulfure ont été exploitées sous de faibles concentrations d'O2 dissous (1 % de saturation d'air) pour minimiser l'oxydation chimique du sulfure. Les faibles concentrations d'O2 ont également entraîné l'expression de l'activité hydrogénase comme observé précédemment41. Des incubations témoins dans des expériences de spectrométrie de masse à entrée de membrane (MIMS) sans cellules ont montré une oxydation négligeable du sulfure à des concentrations micromolaires.

a Culture continue oxydant le méthane. b Culture continue oxydant simultanément de fortes concentrations de CH4 et H2S. c Culture Fed-batch montrant une augmentation de la biomasse 13C avec H2S comme seule source d'énergie. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écarts-types (n = 3 répétitions techniques). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Les méthanotrophes verrucomicrobiens possèdent le cycle de Calvin-Benson-Bassham pour la fixation du CO242, ce qui soulève la question de savoir s'ils peuvent se développer en tant que chimiolithoautotrophe sur le CO2 avec H2S comme source d'énergie. En conséquence, un réacteur fed-batch a été inoculé avec une culture diluée (OD600 = 0,05) du chimiostat double H2S-CH4 et H2S et 13CO2 ont été complétés comme seule source d'énergie et de carbone, tandis que l'alimentation en CH4 a été déconnectée. Au fil du temps, la biomasse des cellules SolV de M. fumariolicum s'est enrichie en carbone 13 en incorporant du 13CO2 dans la biomasse (Fig. 1c). Lorsque la charge en H2S a été augmentée, le pourcentage de biomasse 13C a augmenté en conséquence. La croissance était évidente, car une augmentation de la biomasse de 13C s'accompagnait d'une augmentation du poids sec (Fig. 3 supplémentaire). En quantifiant le H2S dans l'entrée et la sortie de gaz du réacteur, des efficacités de conversion de H2S d'environ 98 à 100 % ont été déterminées tout au long de la période d'incubation.

Les taux de consommation de H2S et les effets inhibiteurs de H2S sur les cellules SolV de M. fumariolicum ont été mesurés à l'intérieur d'une chambre remplie de liquide connectée à un spectromètre de masse à entrée de membrane (MIMS), qui permet la quantification en temps réel et simultanée de plusieurs gaz, tandis que l'O2 a été mesuré par un spot de capteur. Un taux de conversion maximal du CH4 des cellules non adaptées de 200 ± 11 μmol CH4 · min−1 · g DW−1 a été mesuré avec un taux de consommation concomitant d'O2 de 302 ± 9 μmol O2 · min−1 · g DW−1 (Tableau 1). En comparaison, pour les cellules adaptées au sulfure, un taux de conversion maximal de CH4 et un taux de consommation d'O2 concomitant de 33 et 30 % inférieurs ont été mesurés, respectivement. De même, les taux maximaux de respiration du méthanol des cellules adaptées au sulfure étaient inférieurs de 32 % à ceux mesurés pour les cellules non adaptées (tableau 1). En tenant compte du 1 mol O2 requis pour l'activation de 1 mol CH4, les taux de respiration maximaux de CH4 des cellules non adaptées et adaptées au sulfure étaient environ 3 fois inférieurs aux taux de respiration maximaux du méthanol (tableau 1), indiquant la conversion du méthane en méthanol comme étape limitante. De plus, probablement en raison de la faible concentration de dO2 dans les cultures continues, les cellules non adaptées et adaptées au sulfure ont exprimé une activité hydrogénase élevée (tableau 1), avec un rapport de consommation H2:O2 mesuré d'environ 1:0,35 comme prévu32,42. Comme c'était le cas pour la respiration CH4 et méthanol, les taux de respiration H2 maximum des cellules adaptées au sulfure étaient inférieurs à ceux des cellules non adaptées (tableau 1). Ainsi, le gain de capacité accrue d'oxydation de H2S dans les cellules adaptées au sulfure se fait au détriment des capacités de conversion de CH4, méthanol et H2.

Les cellules adaptées au sulfure dans le chemostat ont oxydé le H2S à des concentrations faibles et non inhibitrices (Fig. 1b), ce qui est nécessaire puisque la capacité d'oxydation du CH4 des cellules non adaptées (ainsi que des cellules adaptées au sulfure) a été affectée par une concentration de H2S aussi faible que 1 μM. L'oxydation du CH4 a été inhibée d'environ 25 %, 70 à 85 % et 95 % en présence de 2 μM, 4-5 μM et 10 μM de H2S, respectivement (Fig. 2). L'inhibition de la conversion du CH4 semblait réversible, car lorsque le H2S était consommé ou évacué des incubations à court terme, la conversion du CH4 et la production de CO2 reprenaient immédiatement à leurs taux précédents. Après des périodes plus longues (2 h) d'inhibition par 10 à 20 μM de H2S, les taux de conversion du CH4 étaient inférieurs de 25 à 35 %. Il n'a pas été possible de déterminer si ces taux inférieurs résultaient de l'inhibition du pMMO ou d'autres parties de la chaîne respiratoire, car la conversion du méthanol (CH3OH) était également altérée après de si longues expositions au H2S.

Le H2S a été maintenu à diverses concentrations stables (indiquées en bas) par des ajouts pulsés de H2S dans la chambre MIMS. Les chiffres indiquent les taux de consommation de CH4 en μmol CH4 · min−1 · g DW−1. À 170 min, la chambre MIMS est devenue anoxique, entraînant l'arrêt de la consommation de CH4. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Des taux élevés de consommation initiale d'O2 ont été mesurés lorsque seul le H2S était administré à des cellules non adaptées dans la chambre MIMS. Fait intéressant, ces taux ont immédiatement et rapidement diminué d'environ 15 fois en quelques minutes pour atteindre des taux stables de 10 ± 1 μmol O2 · min−1 · g DW−1 (à 40–80 μM H2S et <10 μM O2). Cette diminution rapide du taux de respiration a indiqué la présence d'oxydases terminales sensibles au sulfure (SSTO) qui ont été rapidement inactivées après l'ajout de H2S et d'au moins un type d'oxydase terminale insensible au sulfure (SITO) responsable du faible taux de respiration restant43. La vitesse de réaction maximale du SITO (10 ± 1 μmol O2 · min-1 · g DW-1) est limitée, car elle ne constitue que 3 % de la vitesse respiratoire maximale de ces cellules non adaptées sur le méthanol (tableau 1). À des concentrations d'O2 10 fois plus élevées (70 à 90 μM d'O2 et 30 à 80 μM de H2S), le taux de respiration restant a augmenté d'environ 40 % (tableau 1), ce qui suggère que l'O2 est en compétition avec le H2S pour le site actif des SSTO, atténuant ainsi l'inhibition du H2S. L'activité de SITO était sensible au cyanure puisque 95 % du taux de respiration était inhibé à 1 mM de cyanure de potassium. Les cellules adaptées au sulfure ont oxydé le H2S avec des taux de consommation d'O2 maximum de 53 ± 4 μmol O2 · min-1 · g DW-1 (tableau 1). Comme à 40–80 μM H2S, les SSTO étaient supposées complètement inhibées, ces valeurs représentent les taux de SITO, qui sont plus de cinq fois plus élevés par rapport aux cellules non adaptées (tableau 1). Le H2S est principalement converti en soufre élémentaire (S0), car une stoechiométrie H2S: O2 de 1: 0,48 (± 0,005; n = 3) a été déterminée après quantification simultanée de la consommation de H2S et d'O2, ainsi que de la production visible de S0 (Fig. 7b supplémentaire).

Les taux de conversion maximaux de H2S à des concentrations faibles (sous-micromolaires) non inhibitrices dans la chambre MIMS étaient difficiles à réaliser en raison de sa consommation rapide qui entraînait une inhibition variable. Alternativement, les taux de conversion maximum de H2S ont été déterminés dans le chimiostat double H2S-CH4 en augmentant progressivement la charge de sulfure à 156 μmol H2S · min-1 · g DW-1 au cours d'une journée tout en surveillant la concentration de sortie (tableau 1). Cette dernière est passée de 2 à 25 nmol · L-1 et est donc restée en dessous d'une concentration liquide de 40 nM, qui a été considérée comme n'affectant pas le pMMO (mesurée par les incubations MIMS). Néanmoins, la conversion du CH4 a diminué d'environ 40 % mais est restée stable pendant des jours. Lorsque, de la même manière, le chimiostat ne recevait que du H2S alors que le CH4 était déconnecté, le même taux de conversion maximal du H2S de 156 μmol H2S · min-1 · g DW-1 a été mesuré. Comme la respiration n'est pas le facteur limitant dans cette configuration (tableau 1), ce taux est considéré comme le taux de conversion maximal de H2S, qui est 1,5 fois supérieur à ce que l'activité SITO peut représenter dans ces cellules adaptées au sulfure et rendue possible par les SSTO qui n'étaient que partiellement inhibés à ces faibles concentrations de sulfure. Des taux similaires ont été mesurés pour les cellules adaptées au sulfure dans la chambre MIMS en présence de 60 à 80 μM d'O2 (tableau 1). Par conséquent, à des concentrations faibles en H2S et/ou en O2 élevées, les cellules présentent les taux de conversion de sulfure les plus élevés, car les SSTO ne sont que partiellement inhibés. De manière notable, le taux de conversion maximal de H2S mesuré ci-dessus dans la chambre MIMS dépassait celui du taux de conversion maximal de CH4 des cellules adaptées au sulfure (tableau 1).

Lors de l'ajout de méthanol pendant la respiration de 20 à 40 μM de H2S par des cellules non adaptées dans la chambre MIMS, la consommation de H2S a cessé immédiatement (Fig. 3a) mais le taux de respiration total a augmenté d'environ 40 %. En revanche, l'oxydation du H2S par des cellules adaptées au sulfure (ayant une activité SITO cinq fois plus élevée) s'est poursuivie à 43% du taux lorsque du méthanol a été ajouté (Fig. 3b), tandis que le taux de respiration total a augmenté d'environ 25% (Fig. 4 supplémentaire). Ainsi, le méthanol et le H2S ont été respirés simultanément et semblent entrer en compétition pour la même oxydase terminale. Lorsque du sulfure (30 µM) a été ajouté à des cellules adaptées au sulfure pendant la respiration du méthanol, la consommation d'O2 a diminué d'environ 3 fois (Fig. 5 supplémentaire). Les taux de respiration restants (66 μmol O2 · min−1 · g DW−1) étaient plus élevés que prévu par rapport au taux de respiration maximal (SITO-dépendant) de H2S (53 ± 4 μmol O2 · min−1 · g DW−1), indiquant qu'au moins du méthanol était encore respiré, ce qui a été confirmé par le fait que le taux de production de CO2 se poursuivait à 20–30 % en présence de sulfure. En revanche, aux mêmes concentrations de H2S, la respiration du CH4 avait presque complètement cessé (Fig. 2).

a Arrêt de la consommation d'H2S par les cellules non adaptées après ajout de méthanol (concentration finale 0,4 mM). b Inhibition de la consommation de H2S par les cellules adaptées au sulfure après addition de méthanol (concentration finale 5 mM). Les chiffres indiquent les taux de consommation en μmol H2S · min−1 · g DW−1. La ligne horizontale noire indique un bref moment d'anoxie pour démontrer que l'oxydation du H2S dépend de l'O2. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

L'ajout de H2S à des cellules non adaptées consommant H2 a diminué le taux de consommation de H2 de 30 %, tandis que la consommation de H2S n'a commencé qu'après l'épuisement complet de H2 (Fig. 4). De plus, la respiration H2 était jusqu'à deux fois plus élevée que la respiration H2S après que tout H2 se soit épuisé. De même, l'oxydation du H2S à 20–40 μM de H2S a été réduite d'environ 80 % lors de l'ajout de 200 μM d'acide formique (CHOOH) (Fig. 6 supplémentaire), tandis que le taux de respiration total a augmenté de 15 %. L'observation selon laquelle le H2S n'est oxydé qu'après l'épuisement du H2 (ou du méthanol) (Fig. 4) suggère des voies de transfert d'électrons compétitives vers l'oxydase terminale insensible au sulfure (SITO) en raison de sa capacité respiratoire limitée. Fait intéressant, lorsque, dans une expérience distincte, 1, 2 mM de H2S a été oxydé comme seule source d'énergie pendant environ 3 h et que les ajouts d'O2 ont été arrêtés, le H2S a été produit dans des conditions anoxiques (Fig. 7 supplémentaire). En théorie, une enzyme productrice de sulfure est utilisée par la souche SolV, réduisant les polysulfures et/ou le soufre élémentaire (S0) produits jusqu'à présent. En revanche, H2 n'a pas été consommé en l'absence de polysulfures et/ou de soufre élémentaire dans des conditions anoxiques, indiquant que ces composés soufrés et non le sulfate présent dans le milieu ont été utilisés comme accepteur d'électrons. La production de H2S a été stimulée jusqu'à 13 μmol H2S · min−1 · g DW−1 lorsque H2 ou méthanol était présent comme donneur d'électrons.

Les nombres verts indiquent les taux de consommation de H2 en μmol · min−1 · g DW−1 avant et après addition de H2S, respectivement. Le nombre et la ligne rouges indiquent le taux de consommation de H2S en μmol · min−1 · g DW−1 après épuisement de H2. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

La cinétique d'oxydation de l'H2S par les cellules adaptées au sulfure a été étudiée à l'aide d'un chromatographe en phase gazeuse, qui a une limite de détection inférieure au MIMS. À partir de 3,5 μM H2S et 190 μM O2, une diminution presque linéaire jusqu'à 1 μM H2S a été observée avec un taux de 167–223 μmol H2S · min−1 · g DW−1 (Fig. 5a). Ces taux sont légèrement supérieurs aux taux de conversion maximum de H2S mesurés dans la chambre MIMS à 5–30 μM H2S et 60–80 μM O2 (tableau 1), ce qui pourrait s'expliquer par les concentrations plus élevées d'O2 et de faible H2S présentes dans les incubations utilisées pour les mesures GC. Étant donné que l'O2 et le H2S sont en compétition pour l'oxydase terminale sensible au sulfure (SSTO), une faible concentration de H2S et une concentration élevée d'O2 atténuent l'inhibition de la SSTO, entraînant des taux de consommation de H2S plus élevés. La modélisation de Michaelis-Menten de la consommation de H2S a donné une constante d'affinité apparente Ks de 0,32 μM H2S. Cependant, les traces de H2S inférieures à 1 μM de H2S n'ont pas suivi la courbe prévue et sont restées légèrement au-dessus (Fig. 5a). Lorsque dans la chambre MIMS, la consommation d'O2 a été suivie jusqu'à zéro à des concentrations de H2S de 15 à 20 μM, une constante d'affinité apparente Ks de 0, 14 ± 0, 01 μM d'O2 a été déterminée, ce qui suit la cinétique de Michaelis-Menten (Fig. 5b). En présence de 15 μM de H2S, SITO n'a pas été inhibé car des taux de consommation d'O2 identiques ont été mesurés après addition séquentielle d'O2 (Fig. 8 supplémentaire). En supposant qu'un seul type d'oxydase terminale soit actif dans ces conditions et que la conversion de H2S ne soit pas le facteur limitant, un Ks de 0,14 ± 0,01 μM O2 pourrait être une valeur fiable pour l'oxydase terminale insensible au sulfure.

une oxydation de H2S mesurée par chromatographie en phase gazeuse. Différents losanges bleus représentent des répliques biologiques (n = 3). La réaction a été initiée par addition de cellules après 33 min. b Respiration H2S mesurée à l'aide d'un spot de capteur d'oxygène à fibre optique dans la chambre MIMS. Les lignes noires indiquent l'ajustement de la courbe de Michaelis-Menten. La réaction a été initiée par addition de cellules à 0 min. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour évaluer comment les cellules SolV de M. fumariolicum s'adaptent au H2S, l'ARNm du double chimiostat H2S-CH4 (cellules adaptées au sulfure) et du chimiostat CH4 (cellules non adaptées), tous deux à l'état d'équilibre, a été extrait et l'expression génique a été quantifiée (tableau 2 ; Fig. 9 supplémentaire ; Données supplémentaires 1). Dans les cellules adaptées au sulfure, l'opéron MFUM_v2_0219-21 était régulé à la hausse d'environ 1,7 fois. Les gènes de cet opéron sont annotés comme déshydrogénase dépendante du NAD (FAD) (MFUM_v2_0219), une protéine homologue à la protéine porteuse de soufre TusA (MFUM_v2_0220) et une protéine porteuse de soufre putative DsrE2 (MFUM_v2_0221), respectivement. Une enquête plus détaillée a révélé que MFUM_v2_0219 encode une sulfure de type III:quinone oxydoréductase (SQR)44. Sur la base de comparaisons de gènes, un deuxième gène (MFUM_v2_0138) pourrait coder pour un SQR, bien que ce gène n'ait pas été régulé positivement de manière significative en présence de H2S et transcrit à un degré beaucoup plus faible que MFUM_v2_0219 dans des cellules adaptées au sulfure (Données supplémentaires 1). Deux gènes (MFUM_v2_0873 et MFUM_v2_1149) ont été transcrits qui pourraient coder pour des dioxygénases soufrées, qui pourraient oxyder putativement le soufre élémentaire en sulfite (SO32−) (Données supplémentaires 1). De plus, les gènes MFUM_v2_0942 et MFUM_v2_0943 ont été régulés positivement 2 fois et 8 fois (tableau 2) et présentent une grande similitude avec les gènes codant pour la protéine cytochrome c SorB et la sulfite: cytochrome c oxydoréductase SorA de Thiobacillus novellus, respectivement45. Dans les cellules adaptées au sulfure, la sulfure dioxygénase putative (MFUM_v2_0873) a été transcrite à un degré similaire à SQR (MFUM_v2_0219). Cependant, sur la base de la stoechiométrie de 1 H2S : 0,48 O2 (± 0,005 ; n = 3) quantifiée dans la chambre MIMS, on pense que la conversion du soufre élémentaire et des polysulfures via le sulfite en sulfate a un rôle mineur dans les conditions testées. De plus, l'oxydation de l'H2S ne s'est jamais accompagnée d'une diminution du pH, ce qui aurait été le cas si le soufre élémentaire avait été oxydé davantage en thiosulfate, sulfite ou sulfate. L'opéron MFUM_v2_1257-61 code pour une cytochrome c oxydase de type ba3 qui a été régulée ~ 5 fois en présence de H2S, en accord avec le taux de respiration SITO 5 fois plus élevé dans les cellules adaptées au sulfure. Fait intéressant, le gène le plus régulé à la hausse (15 fois) code pour une protéine du cytochrome c heptahaem de 89 kDa de fonction inconnue (MFUM_v2_1950), présentant la plus grande similitude avec les gènes trouvés dans les oxydants de sulfure thermophiles. En présence de H2S, plusieurs gènes codant pour des enzymes impliquées dans la biosynthèse du sulfure pour la production de métabolites contenant du soufre (par exemple, la cystéine, la méthionine et le glutathion) étaient fortement régulés à la baisse (tableau 2). De plus, la régulation à la baisse des gènes impliqués dans l'oxydation du CH4 et le transfert d'électrons ultérieur dans la chaîne respiratoire a été observée (tableau 2). Cette régulation à la baisse est conforme à la diminution mesurée des taux maximum de conversion du méthane et de respiration.

L'observation que M. fumariolicum SolV possède un SQR et le fait que CH4 et H2S coexistent dans une grande variété d'environnements nous a incités à rechercher la présence de SQR chez les méthanotrophes. En effet, les gènes codant pour les SQR putatifs sont également répandus dans les méthanotrophes protéobactériennes de divers environnements tels que les lacs, les zones humides, la rhizosphère, les sédiments océaniques, les sols de pergélisol, les rizières, les stations d'épuration des eaux usées, les lacs de soude alcaline, les décharges et les aquifères souterrains (Fig. 10 supplémentaire). Les SQR sont classés en six types différents en fonction de leur structure et diffèrent par leur affinité pour le H2S et leur rôle physiologique dans la cellule44. Des SQR putatifs ont été détectés dans une grande variété de genres protéobactériens dans lesquels un pMMO et/ou un sMMO était présent, tels que Crenothrix, Methylobacter, Methylocaldum, Methylocapsa, Methylococcus, Methylocystis, Methylohalobius, Methylomagnum, Methylomarinum, Methylomicrobium, Methylomonas, Methyloprofundus, Methylosinus, Methylospira, Methyloterricola, Methylotetracoccus, Methylotuvimicrobium et Methylovulum (Fig. 10 supplémentaire). De plus, la souche HY1 de l'alphaprotéobactérie 'Methylovirgula thiovorans' récemment isolée code pour un SQR40 de type I. En revanche, les méthanotrophes verrucomicrobiens possèdent des gènes codant pour un SQR de type III, comprenant des SQR bactériens et archéens dont le moins connu44.

Dans cette étude, nous montrons pour la première fois qu'un micro-organisme peut oxyder simultanément CH4 et H2S, et qu'un méthanotrophe peut produire de la biomasse à partir de CO2 avec H2S comme seule source d'énergie. Nous avons montré que l'oxydation du H2S est nécessaire car le H2S inhibe à la fois la respiration et l'oxydation du CH4. Les cellules ont répondu à la présence de H2S en régulant à la hausse une sulfure de type III:quinone oxydoréductase (SQR) et une oxydase terminale de type ba3 insensible au sulfure (SITO). De plus, nous apportons la preuve d'un mécanisme de détoxification du H2S chez les méthanotrophes, qui, selon les informations génomiques et la co-occurrence du méthane et du sulfure dans une myriade d'environnements, semble être répandu.

On sait très peu de choses sur l'effet de l'H2S sur la méthanotrophie. Un consortium méthanotrophe échantillonné dans une décharge a montré une activité méthanotrophe réduite en présence de H2S46. De plus, l'oxydation du CH4 par Methylocaldum sp. Le SAD2, isolé d'un digesteur anaérobie riche en sulfure, a été significativement inhibé (diminution de 44 à 60 % de la production de méthanol) en présence de 0,1 % de H2S, mais le mécanisme n'a pas été exploré47,48. Il a récemment été démontré que la souche HY1A de « Methylovirgula thiovorans » était capable de consommer divers composés soufrés réduits avec le CH4, mais aucune oxydation simultanée du CH4 et du H2S n'a pu être observée40. Dans la tourbière d'où la souche HY1A a été isolée, la concentration de H2S était inférieure à la limite de détection, ce qui suggère qu'une détoxification vigoureuse du H2S pourrait ne pas être nécessaire. En revanche, les environnements géothermiques où M. fumariolicum SolV et d'autres méthanotrophes verrucomicrobiens résident, sont caractérisés par des concentrations élevées de H2S (de <50 ppm à 20000 ppm)28,35,49. En conséquence, la capacité démontrée à fixer le CO2 avec le H2S comme seule source d'énergie et à oxyder efficacement le H2S en S0 pourrait être très avantageuse dans des systèmes aussi difficiles. Étant donné que plusieurs substrats coexistent dans l'environnement naturel, un mode de vie mixotrophique, dans lequel CH4, H2 et H2S sont utilisés simultanément, devrait être plus bénéfique32,50.

H2S est connu pour se lier à des métaux tels que le cuivre et le fer, ce qui pourrait entraîner une inhibition de la capacité d'oxydation du CH4 du pMMO dépendant du cuivre et des oxydases terminales impliquées dans la réduction de O21,4,5,6,51,52. Fait intéressant, la souche HY1A de « Methylovirgula thiovorans » ne code qu'un sMMO40 dépendant du fer, tandis que M. fumariolicum SolV code pour trois pMMO dépendants du cuivre16. La première souche n'oxyde pas simultanément le H2S et le CH4, tandis que la seconde possède un système de détoxification rapide du H2S pour atténuer l'inhibition de la méthanotrophie. La mesure dans laquelle un type de méthane monooxygénase est inhibé par le H2S pourrait donc influencer le besoin d'un système de détoxification du H2S. Étant donné que chez M. fumariolicum SolV, le gène codant pour un SQR de type III était régulé positivement en présence de H2S, nous proposons que cette enzyme soit responsable de l'oxydation observée du H2S en soufre élémentaire. En effet, il a été démontré que les SQR de type III couplent l'oxydation de H2S à la réduction des quinones chez plusieurs archées et bactéries53,54. Chez les méthanotrophes verrucomicrobiens, on trouve trois types différents d'oxydases terminales : un type aa3, un type ba3 et un type cbb316. La possession de plusieurs types d'oxydases terminales permet une chaîne de transport d'électrons ramifiée, ce qui est très avantageux dans des environnements avec des conditions fluctuantes et une disponibilité variable du substrat et de l'oxygène. Grâce à des études de respiration, nous avons montré que M. fumariolicum SolV possède une ou plusieurs oxydases terminales sensibles aux sulfures (SSTO) et au moins une oxydase terminale insensible aux sulfures (SITO). Parce qu'une oxydase terminale de type ba3 est fortement régulée positivement dans les cellules se développant à des charges élevées en H2S, nous proposons que ce complexe enzymatique spécifique soit le SITO dédié aux méthanotrophes verrucomicrobiens. De même, dans les cellules d'Acidithiobacillus ferrooxidans cultivées au soufre, cette oxydase de type ba3 était régulée à la hausse55. La protéine du cytochrome c heptahème hautement régulée (MFUM_v2_1950) chez M. fumariolicum SolV pourrait être impliquée en tant que transporteur d'électrons du SQR à la chaîne de transport d'électrons. Ce porteur d'électrons putatif pourrait expliquer pourquoi la respiration de H2S continue encore partiellement lors de l'ajout de méthanol dans les cellules adaptées au sulfure et non dans les cellules non adaptées. Dans ce dernier cas, l'absence de ce porteur d'électrons putatif heptahème pourrait être le facteur limitant pour la respiration de H2S, étant annulée par les quantités relativement importantes du porteur d'électrons XoxGJ, médiant le transfert d'électrons du méthanol à l'oxydase terminale56. En revanche, dans les cellules non adaptées, le rapport entre les transcrits des gènes codant pour XoxGJ et le porteur d'électrons putatif heptahème est de 27,6 contre 1,2 dans les cellules adaptées au sulfure. En conséquence, la régulation à la hausse du gène codant pour le porteur d'électrons heptahème pourrait permettre à la respiration du sulfure de se produire en même temps que l'oxydation du méthanol, en utilisant la même oxydase terminale. Le H2S entrave à la fois le SSTO et la réaction catalysée par le pMMO, car à 10 μM de H2S, la conversion du CH4 était presque complètement inactivée tandis que la conversion du méthanol, du formiate et du H2 pouvait encore se poursuivre. La diminution observée de la conversion du CH4 dans le chémostat à une charge maximale de H2S de 156 μmol H2S · min−1 · g DW−1 (concentration de liquide <40 nM) était supérieure à ce que l'on peut attendre de nos études d'inhibition de la conversion du méthane et peut indiquer qu'une grande partie de la chaîne respiratoire est utilisée pour les électrons générés par l'oxydation du H2S, ce qui entraîne un pool de Q trop réduit qui empêche le bon fonctionnement du complexe alternatif III (ACIII). L'oxydation de l'H2S est nécessaire pour maintenir cette molécule à des concentrations faibles et non inhibitrices. Par conséquent, les électrons libérés de cette oxydation doivent être traités par la chaîne de transport d'électrons, ce qui conduit à une compétition de substrat lors de l'oxydation simultanée de plusieurs composés tels que H2S et CH4. De même, il a été proposé qu'un SQR hyperactif chez Rhodobacter capsulatus pourrait conduire à une réduction excessive du pool de quinone57. L'oxydase de type ba3 régulée positivement peut atténuer ce problème en oxydant le quinol et en réduisant l'accepteur d'électrons terminal O2. Chez Aquifex aeolicus, une oxydase de type ba3 apparentée a été trouvée dans un supercomplexe avec SQR58. Il a été démontré que cette oxydase terminale oxyde non seulement le cytochrome c réduit, mais aussi directement l'ubiquinol59. Dans la souche SolV, la protéine heptahème hautement régulée à la hausse pourrait jouer un rôle important en tant que navette électronique dédiée entre l'ACIII acceptant la quinone et l'oxydase de type ba3. Une chaîne de transport d'électrons ramifiée avec différentes oxydases terminales permet une polyvalence et des adaptations métaboliques. Par exemple, E. coli utilise l'oxydase de type bo3 pompant les protons pendant la croissance, mais nécessite les oxydases de type bd insensibles aux sulfures pour continuer à croître en présence de H2S60. Fait intéressant, deux gènes sont présents qui pourraient coder les dioxygénases soufrées (MFUM_v2_0873 et MFUM_v2_1149) pour oxyder davantage le soufre élémentaire. Cependant, la stoechiométrie mesurée de 1 H2S à 0,48 O2, la production de soufre élémentaire et l'absence de production d'acide montrent clairement que le H2S n'est pas oxydé davantage de manière significative. Il reste à étudier si les méthanotrophes peuvent oxyder davantage le H2S en sulfite et sulfate.

Il a été démontré que les cellules de M. fumariolicum SolV oxydent rapidement le H2S avec une faible constante d'affinité apparente (c'est-à-dire une affinité élevée) inférieure à 1 μM de H2S. Les valeurs cinétiques observées ne sont pas surprenantes, puisque H2S inhibe déjà la méthanotrophie à des concentrations aussi faibles. Par chromatographie en phase gazeuse, une constante d'affinité apparente exacte pour les cellules entières n'a pas pu être déterminée, car la consommation de H2S ne suivait pas une courbe typique de Michaelis-Menten. Une limitation de la capacité respiratoire pour l'oxydation du H2S au-dessus d'environ 1 μM peut expliquer un tel écart et pourrait être résolue par la purification du SQR. L'observation selon laquelle M. fumariolicum SolV réduit le soufre élémentaire ou les polysulfures en H2S en présence de H2 ou de méthanol est intrigante. La souche HY1A de « Methylovirgula thiovorans » cultivée sur du thiosulfate produit de plus en plus une enzyme qui ressemble à une protéine connue pour posséder une activité sulfhydrogénase40. Fait intéressant, cette enzyme se regroupe avec l'hydrogénase du groupe 3b [NiFe] de M. fumariolicum SolV, supposée être impliquée dans la production de NAD(P)H pour la fixation du CO250. En effet, il est proposé que ces hydrogénases puissent avoir une activité sulfhydrogénase, ce qui pourrait être un mécanisme pour disposer d'équivalents réducteurs61,62. Par conséquent, l'hydrogénase du groupe 3b [NiFe] de M. fumariolicum SolV pourrait être responsable de la conversion de S0 en H2S. La culture dans des chémostats s'est à nouveau révélée être un outil très puissant pour étudier le métabolisme des méthanotrophes41,63. Grâce à l'adaptation, M. fumariolicum SolV a pu respirer le H2S à un taux cinq fois plus élevé que les cellules non adaptées, probablement en raison de la régulation à la hausse de SQR et de l'oxydase terminale de type ba3.

Les méthanotrophes verrucomicrobiens qui prospèrent dans les environnements géothermiques possèdent un mécanisme clair pour faire face au H2S. En conséquence, le SQR et une oxydase terminale insensible au sulfure pourraient permettre à ces méthanotrophes de prospérer dans des environnements riches en H2S. En effet, le pyroséquençage a montré que les séquences du gène de l'ARNr 16 S lié au méthylacide microbium étaient abondamment présentes dans la couronne des canalisations d'égout en béton riches en CH4 et H2S64. En ce qui concerne les méthanotrophes protéobactériennes, l'effet de l'H2S mérite une enquête plus approfondie. Étant donné que les méthanotrophes aérobies vivent dans des environnements dans lesquels le H2S est souvent présent, nous proposons que le mécanisme de détoxification du H2S est répandu chez les méthanotrophes dans divers environnements.

Le Methylacidiphilum fumariolicum SolV utilisé dans cette étude a été isolé d'un pot en terre de la Solfatara près de Naples, en Italie28. Le génome de cette souche est publiquement disponible et accessible au Genoscope [https://mage.genoscope.cns.fr/microscope/mage/viewer.php?O_id=1176], ainsi qu'à l'EMBL/NCBI (BioProject PRJEA85607; accession ERS14853105). Cet environnement est caractérisé par d'importantes émissions de sulfure, des températures élevées et des valeurs de pH extrêmement basses. Le milieu de croissance était composé de 0,2 mM MgCl2, 0,2 mM CaCl2, 1 mM Na2SO4, 2 mM K2SO4, 7,5 mM (NH4)2SO4 et 1 mM NaH2PO4 et des oligo-éléments à des concentrations finales de 1 μM NiCl2, 1 μM CoCl2, 1 μM MoO4Na2, 1 μM ZnSO4, 1 μM CeCl3, 5 μM MnCl2, 5 μM FeSO4, 10 μM CuSO4 et 40–50 μM d'acide nitrilotriacétique (NTA). Les cellules ont été cultivées en culture continue limitée au méthane à 55 ° C comme décrit précédemment 65, sauf que le pH a été régulé entre 2, 5 et 3, 0, qu'un petit chemostat de 400 ml a été utilisé avec le milieu comme décrit ci-dessus et que H2 n'a pas été complété. La concentration en oxygène a été régulée à 1 % de saturation d'air. De plus, un deuxième chémostat a été utilisé dans des conditions similaires, mais auquel du H2S a été ajouté via une entrée de gaz supplémentaire (Fig. 1 supplémentaire). H2S a été produit en mélangeant 100 mM de Na2S anoxique et 210 mM de HCl dans une bouteille de 50 ml avec une pompe péristaltique. Le courant gazeux argon/C02 (95 %/5 %, v/v) vers le réacteur était conduit à travers cette bouteille. Afin de déterminer le taux de conversion maximal en H2S du chemostat, les cellules ont été progressivement exposées à des concentrations plus élevées en H2S en régulant la pompe péristaltique. Les concentrations de H2S à l'entrée et à la sortie des gaz ont été déterminées par chromatographie en phase gazeuse (décrite dans la sous-section : incubations discontinues et chromatographie en phase gazeuse). Étant donné que le H2S a été fourni par l'entrée de gaz et doit donc être transféré vers la phase liquide, la concentration de H2S liquide sera proche ou inférieure à sa concentration d'équilibre, qui à 55 °C est 1,6 fois la concentration de gaz (calculée à partir du coefficient d'Ostwald à 55 °C)66. De plus, pour observer si M. fumariolicum SolV peut se développer sur H2S comme seule source d'énergie, une culture discontinue alimentée a été opérée dans la même configuration que le système chemostat. Dans ce cas, le flux de milieu a été arrêté et le gaz argon/CO2 a été remplacé par un flux gazeux d'argon uniquement. En même temps, des quantités égales d'une solution de bicarbonate marquée au 13C (50 mM) et d'une solution de HCl (100 mM) ont été ajoutées à la bouteille de mélange de sulfure, créant une concentration de gaz 13C-CO2 d'environ 2 %. Des échantillons de biomasse de 5 ml de la culture fed-batch ont été collectés par centrifugation sur plusieurs jours et les culots ont été lavés avec de l'eau acidifiée (pH 3). Les pastilles ont ensuite été remises en suspension dans de petites quantités d'eau acidifiée et les échantillons ont ensuite été pipetés dans des coupelles en étain et séchés pendant une nuit à 70 ° C sous vide. L'incorporation de 13CO2 dans la biomasse a été évaluée en mesurant le rapport 13/12C à l'aide d'un spectromètre de masse à rapport isotopique Finnigan DeltaPlus (IR-MS) comme décrit précédemment42.

Pour mesurer avec précision les gaz dissous, la spectrométrie de masse à entrée de membrane (MIMS) a été réalisée comme décrit précédemment65, sauf qu'une chambre MIMS de 30 ml a été utilisée. Tous les taux ont été mesurés à 52 °C. La sonde insérée consistait en un tube en acier inoxydable à extrémité émoussée (diamètre 3 mm) perforé de 4 à 16 trous de 1 mm de diamètre. Les trous étaient recouverts de tubes en silicone (Silastic, 50VMQ Q7-4750 Dow Corning, fourni par Freudenberg Medical via VWR international, 1,96 mm de diamètre extérieur x 1,47 mm de diamètre intérieur). Pour faciliter le montage, le tube en silicone a été brièvement trempé dans de l'hexane, ce qui fait gonfler le silicone. La partie métallique a été mouillée avec de l'isopropanol comme lubrifiant. La sonde était directement connectée via un tube en acier inoxydable de 1/8 ou 1/16 de pouce au MS qui fonctionnait à un courant d'émission de 40 μA. Le milieu avec un pH égal à celui de la culture (pH 2,5-3,0) ajouté à la chambre a d'abord été rincé avec 3% de CO2 dans de l'argon gazeux, après quoi la concentration en oxygène a été ajustée à la valeur souhaitée en ajoutant de l'oxygène pur ou de l'air via l'espace de tête. Les masses 15 et 16 sont toutes deux des masses dominantes pour le CH4 dans le spectromètre de masse, mais la masse 15 a un signal de fond beaucoup plus faible que la masse 16 et a donc été choisie pour mesurer le CH4. Le méthane et l'hydrogène (masse 2) ont été ajoutés sous forme de gaz dans l'espace de tête ou, dans le cas de l'étalonnage, à partir d'une solution mère saturée. Ces solutions mères ont été préparées dans une bouteille fermée avec de l'eau à température ambiante et un espace de tête de gaz pur à pression connue. Pour la solubilité dans l'eau, 1,47 mM et 0,80 mM ont été pris pour le méthane et l'hydrogène, respectivement (à 22 °C et 1 bar)66. Lorsque les taux de production de CO2 devaient être mesurés, du bicarbonate de 13C et des quantités équimolaires d'acide sulfurique ont été ajoutés après rinçage à l'argon. De cette manière, la fixation simultanée du CO2 provient principalement du CO2 marqué au 13C (masse 45), ce qui entraîne moins d'interférences avec la mesure de la production de CO2. Au départ, le CO2 non marqué (masse 44) était très faible, et son augmentation reflétait presque exclusivement la production de CO2 à partir de méthane ou de méthanol non marqué.

La stoechiométrie de l'oxydation du H2S a été déterminée par des ajouts pulsés d'une solution mère de sulfure et d'O2 (sous forme de minuscules bulles de gaz avec une seringue) afin de maintenir des concentrations faibles à 1–20 μM H2S et 0–5 μM O2. Au total, 0,7 à 1,4 mM de Na2S ont été ajoutés sur une période de 1,5 à 3 h. Au cours de cette expérience, des quantités équimolaires d'une solution mère d'acide sulfurique 200 mM ont été ajoutées simultanément pour limiter le changement de pH à moins de 0,2 unité. La concentration en oxygène a été mesurée simultanément dans la chambre MIMS au moyen d'un capteur d'oxygène à fibre optique (TROXSP5, PyroScience, Aix-la-Chapelle, Allemagne) collé à l'intérieur de la chambre. Ces taches pourraient mesurer jusqu'à environ 20 nM d'oxygène, ce qui est bien inférieur à ce qui peut être mesuré avec le signal de masse 32 du MIMS.

Pour déterminer les paramètres cinétiques de l'oxydation du H2S par les cellules adaptées au sulfure, des incubations discontinues ont été réalisées dans des flacons de sérum de 120 ml contenant 10 ml de milieu sans aucun oligo-élément. Les oligo-éléments ont été omis pour minimiser l'effet de l'oxydation des sulfures abiotiques. Les bouteilles ont été fermées avec des bouchons en caoutchouc butyle. Les incubations ont été réalisées à 55°C et 350 rpm. H2S a été préparé en mélangeant Na2S avec HCl dans une bouteille fermée. Un volume d'espace libre a été prélevé et injecté dans des flacons de sérum de 120 ml et équilibré pendant 30 min avant de lancer le test par addition de cellules. Le H2S a été mesuré en injectant 100 μL de l'espace de tête des bouteilles avec une seringue en verre Hamilton dans un GC (7890B GC systems Agilent technologies, Santa Clara, USA) équipé d'une colonne en verre Carbopack BHT100 (2 m, ID 2 mm) et d'un détecteur photométrique de flamme (FPD). Les surfaces obtenues ont été utilisées pour calculer les quantités de H2S à l'aide de courbes standard d'étalonnage avec H2S. En bref, 400 μL d'un stock de Na2S 25 mM (sulfure de sodium nonahydraté, pureté > 98 %, Sigma-Aldrich) ont été acidifiés avec 2 mL de HCl 0,5 M dans une bouteille de 574 mL créant une concentration d'espace libre de 17,4 nmol · mL-1. De petits volumes de l'espace de tête ont ensuite été ajoutés à une bouteille de 1162 ml pour créer diverses concentrations de H2S à injecter (0,1 ml) dans le GC pour l'étalonnage. La courbe d'étalonnage variait de ~1 nmol · L−1 à 1 μmol · L−1 H2S.

Pour chaque répétition, 10 ml ont été prélevés du chemostat et les cellules ont été immédiatement culottées pendant 3 min à 15 000 × g, congelées instantanément dans de l'azote liquide et stockées à -80 ° C. Les cellules ont été récoltées à partir de cultures à l'état d'équilibre, ce qui correspond à des paramètres constants sur au moins 5 changements de volume du réacteur. L'ARN total a été isolé à l'aide du kit de purification d'ARN RiboPure™ pour bactéries (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) selon le protocole du fabricant. L'ARN ribosomique a été retiré des échantillons d'ARN total pour enrichir en ARNm à l'aide du kit d'enrichissement d'ARNm bactérien MICROBExpress™ (Thermo Fisher Scientific) conformément au protocole du fabricant. Le kit de dosage Qubit™ RNA HS (Thermo Fisher Scientific) et le kit Agilent RNA 6000 Nano (Agilent Technologies, Waldbronn, Allemagne) et les protocoles ont été utilisés pour l'analyse quantitative et qualitative de l'ARN total extrait et de l'ARNm enrichi. Ce dernier a été utilisé pour la préparation de la bibliothèque en utilisant le TruSeq Stranded mRNA Reference Guide (Illumina, San Diego, CA, USA) selon le protocole du fabricant. Pour l'évaluation quantitative et qualitative de l'ADNc synthétisé, le kit Qubit™ dsDNA HS (Thermo Fisher Scientific) et le kit Agilent High Sensitivity DNA (Agilent Technologies) et les protocoles ont été utilisés. La qualité des lectures de transcriptome a été vérifiée à l'aide de FastQC67, puis coupée de 10 paires de bases à l'extrémité 5 'et de 5 paires de bases à l'extrémité 3' de chaque lecture. Les lectures ont été cartographiées par rapport au génome complet de M. fumariolicum SolV (numéro d'accès LM997411)68 à l'aide de Bowtie269. Le reste de l'analyse et de la production d'images a été réalisé dans la version 4.0.2 de l'environnement R70. Les comptes de lecture cartographiés par gène ont été déterminés à l'aide de Rsubread71 et le changement de pli et la dispersion ont été estimés à l'aide de DEseq272. Avant de faire des statistiques, une analyse en composantes principales sur les 1000 meilleurs gènes par variance de chaque échantillon a été effectuée pour vérifier si les échantillons dans la même condition étaient à la fois similaires à chaque partie de l'échantillon de la même condition et différents de tout autre échantillon. Pour l'expression différentielle, un test de Wald a été utilisé par DEseq2 pour calculer les valeurs p ajustées. Les différences de comptage étaient considérées comme significatives si la moyenne de base était > 4, le changement de facteur log2 était supérieur à [0,58] et la valeur de p ajustée était ≤ 0,05. Pour faciliter les comparaisons entre les échantillons, les valeurs TPM (Transcripts Per Kilobase Million) ont été calculées.

Les concentrations de carbone organique total (TOC) des cultures ont été déterminées à l'aide d'un analyseur TOC-L CPH/CPN (Shimadzu, Duisburg, Allemagne). Les échantillons ont été dilués trois fois dans de l'eau Milli-Q avant les mesures, puis aspergés pendant 20 minutes avec de l'ozone tout en agitant pour éliminer le CO2 du liquide. L'acidification des solutions n'était pas nécessaire en raison du faible pH des échantillons. Une densité optique de 1 mesurée à 600 nm équivaut à environ 450 mg de poids sec (DW) par litre.

Toutes les séquences génomiques disponibles de méthylotrophes connus des ordres Methylococcales (Gammaproteobacteria) et Methylacidiphilales (Verrucomicrobia), des familles Methylocystaceae et Beijerinckia (Alphaproteobacteria) et du genre Methylomirabilis ont été extraites de la base de données NCBI. Les génomes de méthanotrophes ont été sélectionnés en sablant les séquences d'acides aminés de PmoA de Methylococcus capsulatus (SwissProt accession Q607G3) et de sMMO de Methylosinus acidophilus (NCBI accession AAY83388.1) avec un seuil de valeur e de 10−3 et un seuil %-id > 30 %. Les génomes contenant une séquence de méthane monooxygénase ont ensuite été extraits pour des séquences SQR putatives en explosant une séquence représentative de chacun des sous-types SQR tels que définis par des recherches antérieures44 : type I, WP_010961392.1 ; type II, WP_011001489.1 ; type III, WP_009059890.1 ; type IV, WP_011372252.1 ; type V, WP_012502121.1 ; type VI, WP_011439951.1. Les séquences SQR putatives ont été alignées avec celles de l'arbre phylogénétique de 44 en utilisant Muscle 3.8.155173 avec les paramètres par défaut. Un arbre phylogénétique à vraisemblance maximale avec 500 répliques d'amorçage a été construit à l'aide de RAxML 8.2.1074 en utilisant l'option d'amorçage rapide et le modèle de substitution d'acides aminés LG75. L'arbre final a été visualisé à l'aide de MEGA7 et le clade des séquences de sulfure déshydrogénase de flavocytochrome c (FCSD) a été utilisé comme groupe externe.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données de séquençage d'ARN de cette étude ont été déposées dans la base de données NCBI sous le numéro d'accession PRJNA766544. Le génome de Methylacidiphilum fumariolicum SolV a été déposé dans la base de données NCBI sous le numéro d'accession ERS14853105. Les données supplémentaires 1 et le fichier de données source sont également disponibles sur figshare (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22779005). Les données sources sont fournies avec ce document.

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RAS, SSM, TB et HJMOdC ont été soutenus par le Conseil européen de la recherche (projet ERC Advanced Grant VOLCANO 669371), MSMJ a été soutenu par le Conseil européen de la recherche (projet ERC Advanced Grant EcoMoM 339880), WV a été soutenu par la subvention VI.Vidi.192.001 de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO) et SHP a été soutenu par la subvention ALWOP.308 de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO). Nous tenons à remercier le Dr Marianne Guiral et le Dr Frauke Baymann (CNRS, Aix-Marseille Université, Marseille, France) pour des discussions fructueuses. Le LABGeM (CEA/Genoscope & CNRS UMR8030), les infrastructures nationales France Génomique et Institut Français de Bioinformatique (financées dans le cadre du programme Investissement d'Avenir géré par l'Agence Nationale pour la Recherche, contrats ANR-10-INBS-09 et ANR-11-INBS-0013) sont reconnues pour leur soutien au sein de la plateforme d'annotation MicroScope.

Rob A. Schmitz

Adresse actuelle : Institut de biogéochimie et de dynamique des polluants, Département des sciences des systèmes environnementaux, ETH Zurich, 8092, Zurich, Suisse

Département de microbiologie, Institut Radboud des sciences biologiques et environnementales, Université Radboud, Heyendaalseweg 135, 6525AJ, Nimègue, Pays-Bas

Rob A. Schmitz, Stijn H. Peeters, Sepehr S. Mohammadi, Tom Berben, Timo van Erven, Carmen A. Iosif, Theo van Alen, Wouter Versantvoort, Mike SM Jetten, Huub JM Op den Camp & Arjan Pol

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RAS, SSM, AP et HJMOdC ont conçu le projet et les expériences. RAS, SSM, TvE, CAI, TvA, WV et AP ont mené les expériences. TB a effectué des analyses phylogénétiques. RAS, SHP, SSM, TvE, CAI et AP ont effectué des analyses de données. RAS, MSMJ, HJMOdC et AP ont rédigé le manuscrit. RAS, MSMJ, HJMOdC et AP ont supervisé la recherche.

Correspondance à Huub JM Op den Camp.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Christiane Dahl et les autres évaluateurs, anonymes, pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail. Un dossier d'examen par les pairs est disponible.

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Réimpressions et autorisations

Schmitz, RA, Peeters, SH, Mohammadi, SS et al. Oxydation simultanée du sulfure et du méthane par un extrêmophile. Nat Commun 14, 2974 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38699-9

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Reçu : 04 janvier 2023

Accepté : 11 mai 2023

Publié: 23 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-38699-9

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